[发明专利]一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒及应用

说明书

本发明公开了一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒及应用，所述表达盒包括依次连接的启动子核酸序列、RBS核酸序列、编码OmpA信号肽的核酸序列、编码第一促溶肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列、第一终止密码子、RBS核酸序列、编码OmpA信号肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列、编码第二促溶肽的核酸序列、第二终止密码子，其中，第一促溶肽的氨基酸序列为：GEGEG；第二促溶肽的氨基酸序列为：KKKKKK。本发明表达盒能够用于表达获得棘白菌素B脱酰基酶，通过两种特定序列促溶肽的加入，使得棘白菌素B脱酰基酶能够有效且高效表达，发酵培养得到的菌体破碎后酶活可高达57.88U/g。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒及应用。

背景技术

真菌感染是指由真菌微生物引起的感染。近年来，真菌感染造成的死亡人数不断增多，其原因与皮质激素、细胞毒性药物、光谱抗生素及免疫抑制剂等在临床中的广泛应用有关。棘白菌素类药物作为与细胞壁合成酶作用的抑制剂普遍存在抗菌活性强，与其他药物不存在拮抗作用等特点，其中尤以阿尼芬净最为突出，其具有较大的分布容积和光谱抗菌性，不经肝脏代谢，不存在交叉耐药性等优点，而生物法催化生产阿尼芬净前体已经成为国内外抗真菌药物研究的热点。

Echinocandin B脱酰基酶(ECBD)能够通过裂解亚油酰基侧链来催化Echinocandin B(ECB)向环状六肽棘皮菌素B核(ECBN)的转化，这是半合成新型抗真菌药物阿尼芬净(anidulafungin)的关键中间体。Echinocandin B脱酰基酶(ECBD)属于N末端亲核酶(Ntn)水解酶超家族，其前体由信号肽(SP)，α亚基，连接肽(LP)和β亚基组成。

亚基重构(Subunit reconsititution)是指针对多亚基蛋白的一种结构域再安排，与循环排列类似(Circular permutation)，多见于抗体基因在大肠杆菌中的表达，由于在目的基因中含有内含子或连接肽等无功能活性的基因，将原本单链多亚基的蛋白利用基因工程的方法将其独立表达后再利用蛋白的自组装形成活性结构域，该过程本身不会导致对现有蛋白质序列的任何氨基酸取代，而只是重组了多肽链中残基的顺序。而且此方法规避了单链多亚基蛋白在大肠杆菌中复杂的成熟过程，更有利于拥有复杂基因结构的蛋白在大肠杆菌中的成功表达。

近几年来，棘白菌素B脱酰基酶的异源表达宿主主要为链霉菌，如变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌等。但是链霉菌的基因分子操作很不便利，可供使用的载体与改造方法也有限(如更换质粒的拷贝数、更换强启动子与信号肽等方法)。而且其发酵周期与代谢调控与大肠杆菌相比复杂很多。

在通过亚基重构(Subunit reconsitituion)解决了单链多亚基蛋白在大肠杆菌中复杂的成熟过程后，成功将棘白菌素B脱酰基酶大肠杆菌中的活性表达。但是其活性与可溶性并不理想。大量的包涵体在周质空间内聚集，无活性的蛋白甚至对大肠杆菌的生长产生了一定的阻碍。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供了一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒及应用。

一种用于重组表达棘白菌素B脱酰基酶的表达盒，包括依次连接的启动子核酸序列、RBS核酸序列、编码OmpA信号肽的核酸序列、编码第一促溶肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶α亚基的核酸序列、第一终止密码子、RBS核酸序列、编码OmpA信号肽的核酸序列、编码棘白菌素B脱酰基酶β亚基的核酸序列、编码第二促溶肽的核酸序列、第二终止密码子，

其中，第一促溶肽的氨基酸序列为：GEGEG；第二促溶肽的氨基酸序列为：KKKKKK。