[发明专利]一种用于抵御幽门螺杆菌在胃内定植的唾液酸酶

说明书

本发明公开了一种用于抵御幽门螺杆菌在胃内定植的唾液酸酶。属于基因工程疫苗技术领域。唾液酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，并提供了构建方法与应用。本发明采用基因工程技术克隆表达幽门螺杆菌唾液酸酶重组蛋白，上清表达量高，分离纯化步骤简便，免疫效价高且有保护性。唾液酸酶重组蛋白可以直接与黏膜佐剂LT(B)subgt;5/subgt;配合使用，适用于口服免疫接种。

技术领域

本发明涉及基因工程疫苗技术领域，更具体的说是涉及一种用于抵御幽门螺杆菌在胃内定植的唾液酸酶。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是一种革兰氏阴性菌，它感染人后通常能引发患者慢性胃炎、消化性溃疡、胃淋巴增生性淋巴瘤、胃癌等消化系统疾病。幽门螺杆菌从过去的标准三联疗法到现在的四联疗法，幽门螺杆菌根除率却在不断下降。开发一种有效的幽门螺杆菌疫苗可以避免目前根除方法中存在的根除率下降问题。

在近30年的幽门螺杆菌疫苗研究中，开发幽门螺杆菌疫苗的进展非常缓慢，但临床前研究、临床研究和一项在中国范围内的3期临床研究已证明在预防和治疗策略方面取得了成功。这为继续开发一种安全有效的幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。

幽门螺杆菌在定植过程中，其中重要的一环是黏附。目前已有许多幽门螺杆菌黏附因子已经报道。幽门螺杆菌跨过胃黏液层，与宿主上皮细胞黏附，其中可能涉及唾液酸酶。

唾液酸酶(sialidase)又称神经氨酸酶，它是分布于细菌表面的膜蛋白。唾液酸酶可裂解宿主细胞表面的寡糖，暴露出下方的隐性受体，增强对组织的黏附，唾液酸酶具有的此功能已在肺炎链球菌中被广泛研究，同时将其作为肺炎链球菌疫苗成分已被报道。

幽门螺杆菌有1400多个ORF，通过对幽门螺杆菌每个蛋白进行分析，并与NCBI数据库中其它细菌已解析的蛋白功能进行对比，发现幽门螺杆菌被膜上也存在上述蛋白。

因此，将唾液酸酶作为幽门螺杆菌候选疫苗抗原来开发、研制新的幽门螺杆菌疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种用于抵御幽门螺杆菌在胃内定植的唾液酸酶。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于抵御幽门螺杆菌在胃内定植的唾液酸酶，唾液酸酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明提供了编码权利要求1所述的唾液酸酶的基因，基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明提供了一种包含上述基因的重组表达载体。

优选的：重组载体还包括His标签序列、编码促溶蛋白的基因；编码促溶蛋白的基因包括GST和MBP。

本发明还提供了：一种上述重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：

1)采用F234/R234引物对扩增幽门螺杆菌基因组DNA，得到编码唾液酸酶的基因片段；F234的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

R234的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

2)将编码唾液酸酶的基因片段插入骨架载体中得到重组表达载体；骨架载体的多克隆位点为BamHI/EcoR I。

优选的：骨架载体为含His标签序列和编码促溶蛋白的基因的骨架载体；含His标签序列和编码促溶蛋白的基因的骨架载体的构建方法，包括以下步骤：

F29b-1/R502引物对对pMAL-c2X模板进行PCR扩增，得到MBP基因片段；用F502/R29b-07引物对对pGEX-6P-1模板进行PCR扩增，得到GST基因片段；