[发明专利]经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用

说明书

本发明公开了经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用，包括骨髓间充质干细胞来源、并经基因修饰的miR‑34a‑MSC‑MV，特定设计的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用。本发明经慢病毒载体介导miR‑34a在MSCs中的过表达，检测miR‑34a水平。病理观察发现其肾脏组织损伤程度明显得到改善，肾脏间质纤维化、淋巴细胞浸润及肾小管肿胀坏死程度均有明显减轻，肾脏组织病理学评分显著下降。通过体内、外实验，证实了MV、miR‑34a‑MV的修复作用，明确了基因修饰的干细胞及其旁分泌产物的作用，并初步探讨了其作用机制。

技术领域

本发明涉及干细胞微泡技术领域，特别涉及经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用。

背景技术

慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease，CKD)在我国的发病率高达11.8％，已成为继心脑血管疾病、肿瘤和糖尿病后威胁人类健康的又一大原因。肾小管间质炎症和纤维化是导致CKD进展的主要病理基础，其特征为正常肾单位进行性丧失及大量成纤维细胞增殖和细胞外基质的过度分泌，这一过程就类似于组织损伤后的斑痕修复而非正常组织修复。目前临床所采取的治疗措施仅能延缓这一斑痕修复过程的速度，从而延缓CKD进展的速度，但尚无阻断斑痕修复或使损伤肾单位进行正常修复，从而阻断或逆转CKD进展的方法。因此，迫切需要寻求肾损伤修复的新途径。

近年来研究发现骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)在肾损伤修复作用至关重要。MSC具有极强的可塑性，在适宜条件下可跨胚层分化为多种组织细胞，包括骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等；还可能具有向肾实质细胞(如上皮细胞、系膜细胞、足细胞等)分化的潜能，从而参与肾脏损伤的修复和再生。MSC移植是参与肾小管修复和肾功能恢复的主要细胞群体，能够明显改善肾脏功能。既往研究大部分认为骨髓间充质干细胞通过向受损部位归巢，并转分化为肾小管上皮细胞，从而修复肾脏的结构和功能。然而，研究发现MSC移植虽然促进了肾损伤修复，但并未检测到移植MSC分化为肾小管上皮细胞、系膜细胞或足细胞等肾脏固有细胞，提示MSC可能是通过旁分泌作用促进肾损伤修复，这成为MSC在肾损伤修复研究中的一个重要转折。

最新国内外研究表明MSC可能通过微囊泡(microvesicle，MV)释放各种因子，促进肾损伤修复。微泡是从骨髓间充质细胞表面脱落或细胞区室中释放的圆形膜片(直径100nm-1μm)，其主要功能是将各种蛋白质、酶、miRNA和mRNA以微泡的形式运送至靶细胞，发挥相应生物学作用。几乎所有处于静息期和活动期的细胞均可分泌微泡，在应激状态下(如器官组织损伤、感染、肿瘤形成等)，其数量会显著增加。申请者硕士研究期间通过体内外实验证实MSC来源的MV能够促进肾大部切除小鼠模型的肾脏损伤的修复(He Juan,etal.Nephrology.2012；17(5):493-500.)。国外研究也在急性肾缺血模型中发现MSC能够通过其分泌的MV进入受损肾脏细胞而发挥修复作用。无论是在维持肾功能，还是在促进形态学恢复、抑制细胞凋亡等方面，MV均可以发挥类似MSC的作用，而并非必须经过MSC细胞转化为肾小管上皮细胞等肾固有细胞进行肾修复。因此，阐明MSC促进肾损伤过程中MV所分泌的分子标志物及其机制有可能为肾损伤提供新的有效治疗方法。截止到2011年3月，美国FDA已批准应用骨髓间充质干细胞进行临床研究的试验方案共154项，其中已完成I期临床安全性试验109项，III期临床试验2项。我国政府每年投入该方面的科研经费已超过50亿。

国内外学者将MSC应用于急性心肌梗死、脑梗死、肝功能衰竭、大面积烧伤等组织创伤修复上，取得了良好的效果。在心血管领域，研究者通过将MSC移植到动物心梗模型，促使心梗面积缩小，梗死缺血边缘区毛细血管增多，心功能得到改善，动物死亡率下降，并已尝试用于临床治疗。除了将MSC作为细胞移植治疗心肌梗死之外，对其它心肌疾病，如糖尿病心肌病、扩张型心肌病的治疗也有报道。也有学者研究证实MSC能够在移植肝组织内定居存活，在肝移植等肝脏损伤的状况下，正常肝细胞增殖受到抑制，肝脏大量分泌促进肝细胞生长的细胞因子，为移植的MSC提供定居所需的微环境，增加干细胞存活几率，从而进一步发挥组织修复作用。