[发明专利]经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用

权利要求书

1.经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用，其特征在于，包括骨髓间充质干细胞来源、并经基因修饰的miR-34a-MSC-MV，特定设计的微泡在制备治疗肾损伤药物中的应用。

2.如权利要求1所述的经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用，其特征在于，微泡按如下方法提取：

采用全骨髓发分离提取骨髓间充质干细胞，待干细胞贴壁，生长良好，经miR-34a慢病毒感染颗粒转染后，每次细胞换液前，收集培养液，随即将收集的培养液离心3000rpm，25min，吸取上清，保存于-80°c备用；待收集一定量的培养液上清后，集中进行高速冰冻离心，具体方法为：将收集来的无细胞碎片上清培养液经100000g，4℃，离心1h，弃去上清，用含HEPES的无血清培养基-199冲洗，再经相同条件离心后，弃去上清，加入含有HEPES的无血清培养基-199吹打均匀，即得到miR-34a-MV悬液。

3.如权利要求2所述的经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用，其特征在于，所述的骨髓间充质干细胞来源于C57雄性小鼠，由西北大学实验动物中心提供。

4.如权利要求2所述的经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用，其特征在于，对于骨髓间充质干细胞，通过以下方法进行MSC鉴定：①成骨诱导，茜素红染色观察细胞钙盐沉积，②成脂肪诱导，油红O染色鉴定脂肪细胞，③流式细胞术：MSC表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR表面分子。

5.如权利要求2所述的经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用，其特征在于，骨髓间充质干细胞(MSC)来源的微泡(MV)能传递多种遗传信息和生物活性物质。

6.如权利要求2所述的经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用，其特征在于，慢病毒感染：取出-80℃保存的病毒，放入4℃备用，使用前轻轻摇匀，病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，首先观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验，使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基中，吸去细胞中剩余培养基，在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液，混匀后放于37℃，5％CO2的培养箱内孵育过夜，感染48h后，一部分用于后续实验，一部分细胞继续培养，第16-19天Real-time PCR检测miR-34a-5p miRNA的表达，利用总RNA提取试剂盒提取样本总RNA，使用紫外分光光度计NANO 2000测定各样本中RNA的浓度。

7.如权利要求6所述的经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用，其特征在于，病毒数与细胞数比值为50:1。

8.如权利要求2所述的经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用，其特征在于，微泡的提取方法还包括反转录：将得到的RNA样本进行反转录，对上步实验所得的RNA样本进行反转录以得到对应的cDNA，由PCR仪完成，最后得到20μlcDNA样本，置于-20℃保存及后续实验。