[发明专利]猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用

说明书

本发明提供了猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用，属于生物基因工程领域。该方法包括的步骤有：⑴FeIFN‑γ蛋白的信号肽序列和理化性质分析；⑵原核表达质粒pET28a‑SUMO‑FeIFN‑γ的构建；⑶含重组质粒的BL21细菌的诱导表达与重组蛋白的可溶性分析；⑷SUMO‑FeIFN‑γ融合蛋白最佳表达条件的筛选；⑸SUMO‑FeIFN‑γ融合蛋白的大量表达和纯化；⑹SUMO‑FeIFN‑γ融合蛋白的酶切和纯化。本发明克隆不包含信号肽的成熟蛋白基因序列，构建了原核表达质粒，并转化BL21感受态细胞进行表达和纯化，使用了带有SUMO助溶标签的pET28a‑SUMO表达载体，从而实现了目的蛋白的可溶性表达，外源蛋白的可溶性表达水平高，具备很高的生物学活性，纯化步骤简便，为后期抗病毒药物的开发奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，特别涉及猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用。

背景技术

干扰素(interferon，IFN)是一种由机体免疫细胞产生，在诱生剂作用于活细胞后，细胞分泌的一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性的糖蛋白。根据干扰素的来源、生物学性质及活性，将干扰素分Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型干扰素主要起抗病毒和抗肿瘤作用，包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-δ和IFN-ζ，Ⅱ型干扰素中仅有IFN-γ亚型，在抗胞内病原体的宿主防御中起关键作用。1992年，日本东丽株式会社的Nakamura等人首次分离到了猫干扰素基因，将其归类为ω型干扰素，有研究表明IFN-ω对于猫白血病毒(FLV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)共感染的猫以及细小病毒具有明显治疗效果，之后在此基础上证明了IFN-ω对FIV的复制有抑制作用且存在剂量依赖性。由于猫IFN的抗病毒能力相当广泛且具有显著效果，因此研究猫IFN的抗病毒机制和治疗有关猫病毒病的实践中具有重要意义。IFN-γ作为一种新型干扰素，在抗病毒和抗肿瘤方面发挥较强的作用，1995年鸡IFN-γ基因被首次成功克隆，随后成功表达出重组鹅、家兔、猪、牛等动物的IFN-γ并将其用于临床治疗，但有关猫的IFN-γ研究却鲜少被报道。

近年来，人们生活水平迅速提高，带动了养宠业蓬勃发展，与猫有关的疾病特别是病毒性疾病逐年增多。干扰素作为机体重要的防疫系统成员能够对抗病毒感染，而体外表达的干扰素与天然干扰素具有高度相似的生物学活性。所以，体外表达的猫干扰素有望增强宠物猫的免疫力，降低患病率和死亡率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猫干扰素γ的可溶性原核表达和纯化方法及应用，该方法制备得到的猫干扰素γ具有良好的生物活性，能够用于治疗猫病毒感染性疾病。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种猫干扰素γ(feline interferonγ,FeIFN-γ)的可溶性原核表达和纯化方法，包括以下步骤：

(1)FeIFN-γ蛋白的信号肽序列和理化性质分析

通过SignalP-4.0 Server和Expasy在线服务器分别预测、分析FeIFN-γ蛋白的信号肽段和理化性质；

(2)原核表达质粒pET28a-SUMO-FeIFN-γ的构建

根据GenBank收录的FeIFN-γ序列GenBank No.:NM_001009873.1，舍弃掉前20位氨基酸的信号肽设计PCR引物，分别通过引物引入BamH I和HindⅢ酶切位点，进行PCR扩增，然后将PCR产物经双酶切后回收目的基因片段，同时双酶切、回收pET28a-SUMO载体片段，该表达载体是将pET28a进行改造使其在N端His标签后融合一个SUMO标签，经T4 DNA连接酶连接后，转入DH-5α感受态细胞，提取质粒经PCR和双酶切验证后测序，测序正确后命名为pET28a-SUMO-FeIFN-γ；

(3)含重组质粒的BL21细菌的诱导表达与重组蛋白的可溶性分析