[发明专利]一种同时过表达N个miRNA的方法

说明书

本发明公开了一种同时过表达N个miRNA的方法，属于生物技术领域。所述方法包括：S1、针对目标miRNA，设计PCR引物，以基因组DNA为模板，PCR扩增获得包括编码目标miRNA茎环结构以及茎环结构前端160～220bp序列和茎环结构后端160～220bp序列的前体序列片段；S2、将N个miRNA的前体序列片段进行拼接，得到拼接序列；S3、将拼接序列插入到表达质粒的多克隆位点，得到过表达载体；S4、将过表达载体转入受体材料中，N个miRNA同时过表达。本发明方法使得多个miRNA得以同时正常表达，可对多个miRNA同时进行功能研究，在实现miRNA调控作物农艺性状研究中具有重要应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种N个miRNA同时过表达载体的构建及应用。

背景技术

植物microRNA(miRNA)是植物中广泛存在的一种长度为20～22nt的sRNA，其前体基因Pri-miRNA经过Dicer-liker 1(DCL1)两步剪切，分别形成Pre-miRNA和miRNA duplex后，其中miRNA*被降解，另一条成熟miRNA进入AGO蛋白形成RNA沉默复合物(RNA-InducedSilencing Complexes，RISCs)，行使沉默靶标功能。

研究发现证实植物保守的miRNA通过靶标各类转录因子和信号转导的基因调控植物生长发育和抵御逆境的胁迫。miRNA-RISCs对mRNA的作用主要取决于复合体与靶基因转录序列的互补程度，通常一个miRNA可以标靶多个基因，而几个miRNA也可以同时调节一个靶基因，基于这种复杂的调节网络，通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。

对水稻miRNA基因的过量表达是研究其生物学功能的重要策略之一。目前常用的方法是将目的miRNA的前体序列克隆到特定的启动子驱动的双元载体后转化，进而研究miRNA的功能[陈志文，水稻六个miRNA表达载体的构建和遗传转化，2013年4月]。该方法只能对单个水稻miRNA进行研究，无法对多个可能调控同一生物学过程的miRNA同时进行研究。上述方法还因为在载体中常用的启动子为35S启动子而在水稻中表达效果较弱，对miRNA功能研究产生较大限制。因此有必要对以上不足加以改进和创新突破。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可同时表达多个miRNA的方法，以实现多个miRNA同时高效过表达，用于对某一类生理进程具有共同响应的多个miRNA的功能研究。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时过表达N个miRNA的方法，2≤N≤4，包括以下步骤：

S1、针对目标miRNA，设计PCR引物，以基因组DNA为模板，PCR扩增获得包括编码目标miRNA茎环结构以及茎环结构前端160～220bp序列和茎环结构后端160～220bp序列的前体序列片段；

S2、将N个miRNA的前体序列片段进行拼接，得到拼接序列；

S3、将拼接序列插入到表达质粒的多克隆位点，得到过表达载体；

S4、将过表达载体转入受体材料中，N个miRNA同时过表达。

步骤S1中，针对每个目标miRNA，对应其前体基因，设计PCR引物，利用PCR扩增技术获得前体基因片段。

本发明研究发现，构建多个miRNA过表达载体时，能否实现多个miRNA同时成功表达，对于miRNA前体序列长度的选择至关重要，保留Pre-miRNA即茎环结构前后160～220bp序列，多个miRNA得以同时表达。

优选的，步骤S1中，前体序列编码目标miRNA茎环结构以及茎环结构前端190～210bp序列和茎环结构后端190～210bp序列。