[发明专利]几丁质脱乙酰基酶蛋白晶体

说明书

本发明涉及几丁质脱乙酰基酶蛋白晶体，为三维立体结构，所述晶体具有空间P2₁2₁2₁，晶胞参数为所述几丁质脱乙酰基酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明通过晶体结构解析和结构分析获得的结构信息，可进行抗菌剂设计，在防治植物土传真菌病害领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种几丁质脱乙酰基酶蛋白晶体、制备方法及其应用。

背景技术

植物土传病原真菌病害造成农作物减产，甚至绝产，严重威胁着我国农业生产和社会经济稳定，目前还没有针对性的高效绿色抗菌剂。几丁质脱乙酰基酶是病原真菌逃避植物免疫的一个关键致病因子，植物土传致病真菌通过分泌几丁质脱乙酰基酶对细胞壁重要结构成分几丁质进行脱去乙酰基团的修饰，从而逃避几丁质诱发的植物免疫识别。几丁质脱乙酰基酶活性缺失会使病原真菌丧失致病性，并且在人和植物中不存在同源蛋白，因此利用小分子化合物抑制几丁质脱乙酰基酶活性可能是防治病原真菌的绿色有效策略。

随着结构生物学和虚拟筛选技术的发展，基于结构的筛选和设计已经成为抑制剂开发重要途径。2013年Lamberth等人在《Science》上发表的文章《Current challenges andtrends in the discovery of agrochemicals》明确指出：“Structure-based design isa growing discipline within crop protection research”(基于靶标结构的农药设计是作物保护领域中的一门新兴学科)。因此，植物土传病原真菌几丁质脱乙酰基酶的晶体结构对于进一步基于结构信息筛选获得高效的抑制剂至关重要，是基于靶标的新药开发的核心基础和重要依据。然而，目前尚未有植物土传病原真菌几丁质脱乙酰基酶的结构被报道，极大地限制了植物抗菌剂的开发。

发明内容

鉴于现有技术的需求，本发明提供一种植物土传致病真菌的关键致病蛋白几丁质脱乙酰基酶晶体，通过晶体结构解析和结构分析获得的结构信息，可进行抗菌剂设计，在防治植物土传真菌病害领域具有广阔的应用前景。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

几丁质脱乙酰基酶蛋白晶体，为三维立体结构，所述晶体具有空间P2₁2₁2₁，晶胞参数为所述几丁质脱乙酰基酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述晶体的一个不对称单位中有五个分子。

所述晶体具有(β/α)₇桶状结构。

所述晶体的活性中心具有一个锌离子，其与Asp56、His108、His112形成金属三联体结构。

所述晶体的底物结合口袋附近具有6个环状结构，构成了短且深的呈电负性的底物结合裂缝，并且在底物结合裂缝分布了四个疏水的芳香族氨基酸，形成了-1、0、+1、+2四个底物结合位点。

涉及的环状结构序列为KNFGELKNYV、HTWDHPYLTQLS、RPPYFDYNAKT、HADLDTNDWKFD、GVANNR、VHETTV。

所述的芳香族氨基酸为Phe85、Phe150、His168、Trp177。

所述蛋白晶体的制备方法，包括：(1)将纯化的蛋白在pH7.4的0.02M Tris、0.1M氯化钠缓冲液中浓缩至10mg/mL；(2)在4℃条件下，采用悬滴扩散法形成几丁质脱乙酰基酶的蛋白晶体；所述几丁质脱乙酰基酶晶体形成条件为：将1μL蛋白溶液置于1μL池液的液滴中生长，所述池液的组成为pH 6.8的0.1M丙二酸钠、0.1M Hepes缓冲液、0.7％v/v聚醚胺ED-2001。

该生长条件尤其适用于大丽轮枝菌几丁质脱乙酰基酶VdPDA1蛋白晶体的生长。