[发明专利]基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的制备方法及应用，所述制备方法包括以下步骤：构建体外表达载体，并经质粒线性化、体外转录和纯化后得到RNA疫苗；基于采集的PBMC获得T细胞和RNA疫苗修饰的DC细胞；将RNA疫苗修饰的DC细胞和T细胞扩增培养，得到基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞。本发明使用pcDNA3.1+质粒，构建哺乳动物体外表达载体，相对于传统多肽合成，制备周期短，成本低，制备成功率高；使用电转仪进行电转，相对于传统转染方式，重复性好，无试剂费用，电转率高；使用RNA疫苗电转DC细胞，相比于其他生物治疗药物，易在体外生产和纯化，生产工艺通用性强，安全性高；将电转后的DC细胞和T细胞共孵育扩增，获得的活化的疫苗比例高，免疫原性强。

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种基于RNA疫苗的抗原反应性T细胞的制备方法及应用。

背景技术

恶性肿瘤是全球发病率最高的疾病之一，它和心血管病和脑血管病排在前三位。在我国也同样是这三个病种排在前三位。目前，临床上以手术、放疗、化疗为主的综合治疗效果并不理想，近年来分子靶向治疗的广泛应用虽显著改善了部分恶性肿瘤的预后，但靶向治疗获益人群少且最终均面临耐药性的问题。大多数非非恶性肿瘤患者并不存在这些致癌基因突变，治疗手段仍以传统放化疗为主，预后不佳。因此，新的恶性肿瘤治疗手段研究迫在眉睫。

随着肿瘤免疫学和临床免疫治疗应用的深入，肿瘤免疫治疗正成为继手术、放疗、化疗、靶向治疗之后的一种常规治疗手段。肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域的研究热点。2013年，肿瘤的免疫治疗被《Science》杂志评为年度十大科学突破之首。2016年，美国临床肿瘤学会(ASCO)宣布免疫治疗为年度肿瘤研究的首要进展。肿瘤新生抗原(neoantigens)是肿瘤细胞由于基因变异而产生的特异存在于肿瘤细胞中的多肽或者蛋白，其上面载有的一些新生抗原表位能被免疫系统识别，从而精准地攻击肿瘤细胞。以肿瘤新生抗原为靶点的治疗，相较于传统的肿瘤相关抗原治疗具有特异性强、对正常组织伤害小、自身免疫概率低、可多靶点同时进行治疗等优点，能够特异性激活细胞毒性T细胞，实现对肿瘤细胞的杀伤。

研究表明，基于肿瘤新生抗原的治疗通过激活和提高受试者体内新生抗原特异性T细胞的比例及活性，靶向杀伤受试者的肿瘤组织。2017年7月，《nature》上同日刊登两篇以新生抗原为靶点成功治疗晚期黑色素瘤的临床研究，力挺基于新生抗原的个体化肿瘤治疗模式。其中，Ugur Sahin的研究团队纳入13例晚期黑色素瘤受试者，经治疗后8人肿瘤完全消失；Patrick的研究团队纳入6名受试者，经治疗后4人肿瘤完全消失，在32个月内没有复发，另外两人在接受PD-1辅助治疗后肿瘤也完全消失。与此同时，基于新生抗原的精准免疫治疗在一些实体瘤如胆管癌和结直肠癌中也展现出惊人的疗效。

综上所述，基于受试者个体化肿瘤新生抗原的免疫治疗，是目前国际上最先进的精准靶向治疗恶性肿瘤的方案之一。

在2014年，Steve Rosenberg的研究团队在《Science》杂志发表了关于采用新生抗原反应性T细胞治疗晚期胆管癌患者的文章。他们采集了患者肿瘤组织和外周血进行测序，对测序数据进行突变分析，从突变基因中筛选新生抗原，制备RNA疫苗，然后在体外与患者TIL细胞进行共孵育，获得肿瘤新生抗原特异性的TIL细胞并进行大量扩增，随后回输进入患者体内。临床数据显示，患者肿瘤明显缩小，病情趋于稳定。该团队于2016年在《NEJM》杂志上又发表了一篇关于采用相同的T细胞疗法成功治疗一例转移性结直肠癌患者的文献。2019年，南京鼓楼医院的一项基于肿瘤新生抗原反应性T细胞的过继性疗法研究，采用肿瘤个性化疫苗和NRT(Neoantigen Reactive Tlymphocyte)细胞疗法联用的方式，对17例晚期癌症患者进行治疗。其中，一位转移性胸腺瘤患者在治疗后29个月内获得了完整而持续的免疫反应。在另一位转移性胰腺癌患者中观察到免疫相关的部分反应。其余4位患者实现了疾病的长期稳定，中位无进展生存期为8.6个月。

上述研究结果表明，基于新生抗原反应性T细胞的疗法具有一定的有效性，但是还是部分患者无法从NRT疗法中受益。