[发明专利]SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白及其亚单位疫苗

说明书

本发明提供了一种SARS‑ConV‑2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白及其亚单位疫苗，编码所述重组蛋白的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14所示中的一条；所述新型冠状病毒亚单位疫苗包含所述的重组蛋白以及药学上接受的佐剂。本发明对S蛋白膜外结构域表面抗原决定簇进行筛选，找到能够刺激细胞产生强免疫反应的Sn1‑Sn7肽段基因序列，进行密码子优化后克隆到含有白喉毒素T结构的质粒载体上，分泌表达和纯化，获得的重组蛋白经实验验证可诱导特异性细胞反应，安全高效，具有良好的开发和应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白及其亚单位疫苗。

背景技术

SARA-Cov-2属于冠状病毒科β-冠状病毒属，与严重急性呼吸综合征(severeacute respiratory syndrome，SARS)冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征(MiddleEast respiratory syndrome，MERS)冠状病毒(MERS-CoV)为同一属。SARA-Cov-2为正链单链 RNA病毒，基因组为29.9kd，对RNA病毒来说，基因组较大，共编码9860个氨基酸。基因组包括5’端的帽状结构和3’的Ploy A尾巴，编码16个非结构蛋白的复制酶基因靠近5’端，约占整个基因组的2/3，其余1/3基因组编码4种结构蛋白。将已知的多种冠状病毒的基因组进行序列比对，发现在全基因组水平上同源性为54％，结构蛋白和非结构蛋白的编码基因同源性分别为58％和43％，这表明结构蛋白更加多样化。冠状病毒的S蛋白是病毒体外壳上的I类病毒融合蛋白，通过识别宿主细胞表面受体并介导病毒与细胞膜融合，在病毒感染中发挥重要作用。S蛋白含有S1和S2两个亚基，研究发现SARS-Cov-2与SARS-Cov病毒表面的S蛋白S1亚基具有较高的同源性，主要体现在SARS-Cov-2的受体结合域(receptor bindingdomain，RBD)拥有与SARS-Cov几乎相同的三维空间结构，这表明两种病毒结合的受体相同，即都是通过ACE2受体感染支气管上皮细胞和肺上皮细胞。基于S蛋白在SARS-Cov-2病毒在感染中的关键作用，其可以成为治疗药物设计的靶点。

mRNA疫苗虽然研发很快，避免了体外繁琐的病毒培养或重组蛋白表达的过程，只需进行特定mRNA序列的合成，再利用脂质体包埋后注射到人体肌肉组织，mRNA进入组织细胞后表达出病原蛋白引发人体免疫应急反应，但mRNA 疫苗因各种问题造成没有一株疫苗通过临床实验。例如：有的人对外源性RNA很敏感，还没表达就降解了；有的人又不敏感，能长期表达，结果造成抗原耐受，产生不了抗体；还有人因病原性抗原的细胞内表达，通过与细胞内蛋白的相互作用产生强烈的毒副作用等。在临床研究中这些严重的副反应，不仅位于注射部位的副反应，还包括全身的副反应。研究认为mRNA疫苗在体内持续表达产生抗原蛋白，可能打破机体本身的免疫平衡，引发免疫耐受。除了潜在的副作用，一些临床研究结果还证明mRNA疫苗在人体中的药效比动物体内低的多，表明还需要进一步研究动物与人对mRNA疫苗的应答差异，到底人体中哪条免疫通路最为有效？是否可以通过改变疫苗的免疫刺激表达来改善药效？这些都是需要解决的问题，mRNA疫苗还有很长的路要走。

而与mRNA疫苗相比，重组蛋白亚单位疫苗在某些方面也具有一定的优势。首先，所需设备简单，易于大规模生产，且避开了对毒株的灭活或减毒等步骤，安全性高；其次，重组蛋白疫苗属于主动免疫，具有长效预防作用，是对治疗型mRNA疫苗的一种绝好补充；另外，重组蛋白疫苗不存在像mRNA疫苗类似的在体内持续表达的问题，不会造成免疫耐受；而且，与mRNA疫苗相比，重组蛋白疫苗的保质期更长，更利于战略性储备；最后，重组蛋白亚单位疫苗仅有几种主要表面蛋白质，避免产生许多无关抗原诱发的抗体，从而减少疫苗的副反应和疫苗引起的相关疾病。