[发明专利]一种用于促进创面愈合的间充质干细胞囊泡修复液

说明书

本发明属生命科学技术领域，公开了一种间充质干细胞囊泡修复液的制备方法，所述间充质干细胞囊泡修复液由间充质干细胞囊泡与含3～5％人血清替代物的培养基组成。本发明选用脂肪间充质干细胞，在细胞培养融合度为75～85％时收集细胞和培养基上清，利用微量脂质体挤出器将细胞以微孔过滤的方法制备细胞内囊泡，同时利用聚乙二醇(PEG8000)沉淀的方法制备培养基上清中的细胞外囊泡。将细胞内外囊泡混合，用含3～5％人血清替代物的培养基为溶媒配置修复液，该修复液可用于促进皮肤创面修复，加速伤口愈合。

技术领域

本发明属生命科学技术领域，公开了一种间充质干细胞囊泡修复液的制备方法，所述间充质干细胞囊泡修复液由间充质干细胞囊泡与含3～5％人血清替代物的培养基组成。本发明选用脂肪间充质干细胞，在细胞培养融合度为75～85％时收集细胞和培养基上清，利用微量脂质体挤出器将细胞以微孔过滤的方法制备细胞内囊泡，同时利用聚乙二醇(PEG8000)沉淀的方法制备培养基上清中的细胞外囊泡。将细胞内外囊泡混合，用含3～5％人血清替代物的培养基为溶媒配置修复液，该修复液可用于促进皮肤创面修复，加速伤口愈合。

背景技术

脂肪间充质干细胞属于成体干细胞中的一类多能干细胞，它具有干细胞的共性，即自我更新和多向分化能力，相较于其他类型的干细胞而言，其具有低免疫原性与无致瘤性的特点。脂肪间充质干细胞广泛应用于关节病、自身免疫性疾病、心血管系统疾病等的研究。研究发现，脂肪间充质干细胞可能是通过旁分泌产生细胞外囊泡与外泌体发挥其生物学效应。细胞外囊泡是细胞主动释放的纳米级膜囊泡。基于其生物发生、大小和生物物理性质，可以进一步分类(例如外泌体、微泡等)。最初囊泡被认为是细胞碎片，但随着研究的不断深入，细胞外囊泡越来越被认为是细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体。

间充质干细胞来源的囊泡与外泌体因其本身携带丰富的蛋白质、RNA、DNA等活性物质，被发现具有促进组织修复、免疫调节功能。从脂肪组织分离出的外泌体通过影响成纤维细胞的特性来加速皮肤伤口的愈合，来自间充质干细胞的细胞外囊泡也显示出相似的特性。研究发现，间充质干细胞外泌体中含有丰富的Wnt蛋白，能活化β-catenin信号通路，同时通过激活ERK1/2信号通路正调控成血管基因——VEGFA、Cox-2、FGF2等的表达，进而促进了二度烧伤大鼠模型深部创伤后血管的重生、胶原蛋白合成和皮肤损伤修复。

间充质干细胞囊泡与外泌体在创面修复、皮肤抗老、瘢痕修复等方面有着显著的治疗效果，因此如何从细胞液中有效地提取并获得完整的外泌体是开展外泌体研究的前提与关键。当前外泌体的分离方法包括超速离心法、聚合物沉淀法、体积排阻与超滤法、免疫亲和捕获法和微流体芯片技术等，其中超速离心法又称差速离心法是外泌体分离的标准方法，该方法虽然成本不高，但最终所得外泌体纯度低，且需要进行再提纯，回收率不稳定，故其是一个耗时耗力的过程。最近也有实验将超速离心法与蔗糖密度梯度离心法组合起来用于分离低丰度外泌体。因技术限制，囊泡与外泌体的获得成为其向临床应用转化的一个无法避免的问题。

针对现有的技术问题，本发明提供了一种可有效提高脂肪间充质干细胞囊泡产量的方案，采用微孔过滤的方法分离细胞内囊泡，并在此基础上通过聚乙二醇沉淀进一步分离收集细胞培养基中的细胞外囊泡。进一步通过急性皮肤切除创伤小鼠模型评价干细胞囊泡制备而成的修复液对创面愈合的效果。结果显示，在实验第4、6、9天利用修复液进行治疗的处理组愈合率显著高于对照组，表明间充质干细胞囊泡修复液可有效促进伤口创面愈合。

发明内容

本发明的目的是提供一种可提高脂肪间充质干细胞囊泡产量的方案。

本发明的另一目的是制备一种可用于促进创面愈合的修复液，并用急性皮肤切除创伤小鼠模型评价其促进创面愈合效果。

具体实施方案

1.脂肪间充质干细胞培养