[发明专利]一种用于促进创面愈合的间充质干细胞囊泡修复液

权利要求书

1.一种用于促进创面愈合的间充质干细胞囊泡修复液，其特征在于，所述间充质干细胞囊泡修复液由脂肪间充质干细胞囊泡与含3～5％人血清替代物的培养基组成，按照3～5mg/mL蛋白浓度的比例将干细胞囊泡与含3～5％人血清替代物的培养基混合。

2.一种如权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，脂肪组织经过酶消化法分离培养获得原代脂肪间充质干细胞，液氮冻存；

第二步，原代脂肪间充质干细胞复苏后，进行传代扩大培养；

第三步，脂肪间充质干细胞传代至第五代，当细胞培养融合度达到75～85％时，收集干细胞和培养基上清用于制备间充质干细胞囊泡。

3.一种如权利要求2所述的间充质干细胞囊泡的制备方法，其特征在于将细胞以微孔过滤的方法制备细胞内囊泡，同时利用PEG8000沉淀的方法制备培养基上清中的细胞外囊泡，将细胞内外囊泡混合。

4.一种如权利要求3所述的细胞内囊泡的制备方法，其特征在于，利用微量脂质体挤出器(品牌：avanti；货号：610000)对脂肪间充质干细胞进行物理挤压，形成直径更小的含有细胞内容物的囊泡。

5.一种如权利要求3所述的制备细胞外囊泡的方法，其特征在于，如权利要求2所述的培养基上清收集后，按照质量体积比6～10％添加PEG8000至培养基上清，混匀室温静置过夜后离心收集细胞外囊泡沉淀。

6.一种如权利要求1所述间充质干细胞囊泡修复液的安全性检验，其特征在于，选用含3～5％人血清替代物的培养基重悬间充质干细胞囊泡，利用超微量紫外分光光度计(品牌：Thermo Scientific^TMNanoDrop^TMOne)进行蛋白浓度测定，根据测得数据将溶液蛋白浓度调整至3～5mg/mL，取样进行无菌、内毒素、支原体检测，结果间充质干细胞囊泡修复液的无菌、支原体检测结果为阴性；内毒素＜0.5EU/mL。安全性检验结果合格。

7.一种急性皮肤切除创伤小鼠模型，用于对修复液的治疗效果进行评价。选用4～5周龄雄性KM小鼠进行背部皮肤切除造模，取权利要求1所述的间充质干细胞囊泡修复液均匀滴在创面上给药，给药体积为100μL/只/次，给药时间为第1、4、6、9、11天。

8.一种评价小鼠创面愈合情况的方法。其特征如权利要求7所述，拍照记录小鼠创面愈合情况，采用ImageJ(V 1.80版本)软件进行计算机图形处理测算创面面积，按照如下公式计算创面愈合率。