[发明专利]一种同时检测血清中4种脂溶性维生素的浓度的方法

权利要求书

1.一种同时检测血清中4种脂溶性维生素的浓度的方法，其特征在于，采用二维液相色谱系统及柱切换技术相结合，对去除蛋白后的血清待测样品进行检测，所述4种脂溶性维生素为维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3和维生素E；所述血清待测样品是取血清待测液，加入体积比10:1的内标工作液，涡旋混匀；再加入体积比1:3的蛋白沉淀剂，涡旋混匀后，在10000-15000rpm的高速离心机中离心10-15min，移取上清液进样检测；所述蛋白沉淀剂是体积比为4:1的乙腈-甲醇混合溶液；

所述二维液相色谱系统及柱切换技术具体是：构建二维液相色谱分析装置，第一维液相色谱采用等度洗脱，进样后，样品随流动相进入前处理柱进行净化和富集，然后进行流路切换，样品进入第二维液相色谱部分的分析柱进行分离，最后进入检测器检测，在第二维液相色谱部分采用梯度洗脱；洗脱后得到色谱图，根据色谱图的不同物质和内标的峰面积，根据已建立好的标准曲线方程，计算出待测样品的目标物浓度；

所述二维液相色谱系统及柱切换技术中，第一维液相色谱部分中的前处理柱为4.0×20mm的苯基柱，前处理流动相为甲醇的35％水溶液，流速为2mL/min；第二维液相色谱部分中的分析柱为50×3.0mm,2.7μm的C18柱，分析流动相为含0.02％甲酸的甲醇和含0.02％甲酸的水，流速为0.7mL/min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二维液相色谱系统及柱切换技术中，色谱柱温为25～50℃，进样量是50～100μL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述色谱柱温为40℃、进样量50μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线方程的建立方法是：取标准曲线工作液，加入体积比10:1的内标工作液，涡旋混匀；再加入体积比1:3的蛋白沉淀剂，涡旋混匀后，在10000-15000rpm的高速离心机中离心10-15min，移取上清液进样检测；在色谱图上得到各物质的峰面积，以某一物质的溶液浓度为横坐标x，以该物质和内标的峰面积比值为纵坐标y，采用最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程y＝a*x+b。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述内标工作液为维生素A-d6：500ng/mL，25-羟基维生素D2-d6：200ng/mL，25-羟基维生素D3-d6：200ng/mL，维生素E-d6：20μg/mL的混合溶液。