[发明专利]外泌体用于防止脑型疟疾发生的实验方法

说明书

本发明的是外泌体用于防止脑型疟疾发生的实验方法，包括利用P.y17XNL鼠疟模型，提取外周血后超速离心法或磁珠免疫捕获法分离纯化外泌体；利用外泌体或外泌体联合CpGODN免疫正常C57BL/6J小鼠，固定时间点P.bANKA攻击，动态观察感染过程、神经系统症状和血脑屏障(BBB)完整性，确定外泌体的免疫效应。通过提取异种疟原虫感染后宿主外周血中的外泌体，采用尾静脉注射单独免疫外泌体或皮下注射外泌体联合CpGODN两种方法于0天和20天分别免疫C57BL/6J小鼠两次，第二次免疫20天后1×10supgt;6/supgt;P.bANKA寄生的红细胞(pRBC)攻击免疫小鼠。实验结果发现，与模型组相比，免疫组小鼠虫血症明显降低，生存率高达90‑100％。神经系统症状未出现，且小鼠BBB保持完整性；证明外泌体可有效保护C57BL/6J小鼠防止脑疟的发生。

技术领域

本发明涉及疟疾预防技术领域，具体涉及一种外泌体用于防止脑型疟疾发生的实验方法。

背景技术

疟疾是一种严重危害人类健康的全球感染性疾病。据2020WHO疟疾报告，2019年全球有89个国家和地区流行疟疾，约2.29亿人感染，因疟疾而死亡的人数达40.9万。特别是在非洲等发展中国家，疟疾仍然是5岁以下儿童死亡的主要原因。仅在撒哈拉以南非洲地区每年至少20万人死于重症疟疾，其中恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum，Pf)引起的脑型疟疾(简称脑疟，cerebral malaria,CM)是重症患者致死的主要原因。CM致死率高达15-25％，死亡人数占疟疾总死亡人数的90％，而且四分之一幸存病人还会患有长期的神经和认知缺陷。

因此深入了解CM发生、发展过程中相关致病机制及疟原虫与宿主相互作用是全球范围内控制和根除疟疾、开发有效疟疾疫苗的基础和前提。

寄生虫与寄生部位的组织均能够分泌外泌体，但虫源外泌体与宿主源外泌体难以区分。目前组织外泌体的提取尚处于起步阶段，因此选择最佳提取方法是未来工作的重点。虫源外泌体作用于宿主的机制仍不明确，其调控宿主细胞的生物活性物质还有待研究。

发明内容

本发明提出的一种外泌体用于防止脑型疟疾发生的实验方法，可解决上述技术问题。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种外泌体用于防止脑型疟疾发生的实验方法，包括：

S1、利用P.y17XNL鼠疟模型，提取外周血后超速离心法或磁珠免疫捕获法分离纯化外泌体；

S2、利用外泌体或外泌体联合CpGODN免疫正常C57BL/6J小鼠，固定时间点P.bANKA攻击，动态观察感染过程、神经系统症状和血脑屏障(BBB)完整性，确定外泌体的免疫效应。

进一步的，所述S1具体包括外泌体提取和外泌体鉴定；

其中，外泌体提取包括BALB/c小鼠经腹腔注射1×10⁶P.y17XNL寄生的红细胞(pRBC)，确定虫血症20％-30％后提取外泌体；

采用超速离心法或磁珠免疫捕获法提取P.y17XNL感染的BALB/c小鼠外周血中的外泌体，测蛋白浓度后置于-80℃冰箱中备用；

所述外泌体鉴定包括采用透射电镜和WB方法对上述提取的外泌体形态结构、粒径大小和表面特异性分子的表达进行分析。

进一步的，所述S2具体包括即外泌体免疫步骤如下：

C57BL/6J小鼠尾静脉注射外泌体5μg/只，于0天和20天各免疫一次；第二次免疫后20天C57BL/6J小鼠经腹腔注射1×10⁶P.bANKA寄生的红细胞pRBC；