[发明专利]一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法

说明书

本发明公开了一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法，该方法采用液质联用系统测定，先取待测样品，加入一定量的混合有机溶剂进行蛋白沉淀，离心后进行上清液的稀释，预处理后，取适量测试样品注入高效液相色谱‑串联质谱仪中，测试样品中的利福平和内标利福平‑d3的色谱峰，并计算所述血浆样品中的利福平的浓度。本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为利福平的血药浓度测定提供依据；并且本发明预处理方法简便，适用于常规测定。

技术领域

本发明涉及血浆中利福平测定技术领域，尤其涉及是一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法。

背景技术

利福平是一种所属利福霉素家族的一种广谱抗生素药物，对结核杆菌有较强抗菌作用，对革兰氏阳性或阴性细菌、病毒等也有疗效。为红色或暗红色的结晶状粉末，不溶于水。一般为胶囊或者片剂口服药，与其他抗结核药合用起协同作用，并延缓耐药菌株产生。主要用于治疗结核病、脑膜炎和金黄色葡萄球菌感染。因此，利福平制剂的药用经济性高，具有广阔的市场前景。人体服用利福平后，由于药物的相互作用，关注人体血浆中利福平浓度是非常有必要的。

然而，目前关于血浆中利福平的高效液相质谱检测方法未见报道，现有的利福平检测方法并不能满足其检测需求。因此建立一种稳定、可靠、准确、快速的血浆中利福平测定方法具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提出的一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法可提高血浆中利福平检测的速度、精度和灵敏度。该方法血浆样品经预处理后经高效液相色谱-串联质谱检测其浓度，具体方法包括以下步骤：

S1，血浆样品预处理：

以K2-EDTA为抗凝剂，以利福平-d3为内标；于96深孔板中精密加入50μL的血浆样品，加入50μL的1μg/mL的内标利福平-d3溶液，混匀后加入200μL有机溶剂甲醇于96深孔板中，涡旋混合；于4℃以4200rpm离心10min，取上层清液50μL至装有300μL混合有机溶剂(混合有机溶剂为甲醇)的96深孔板中；水按照体积比50：50混合得到的混合物，涡旋混匀；于4℃以4200rpm离心10min后作为测试样品待检测；以上过程中除了离心均需于室温黄光条件下操作。

S2，液相色谱条件：

WelchΜltimate XB-C18，5μm，柱规格为2.1x 100mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：乙腈；洗液：乙腈/水/甲酸的体积百分比为80/20/0.1；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为5μL，分析时间4.0min。

进一步地，所述梯度洗脱选用二元高压梯度洗脱，所述二元高压梯度洗脱程序为：

S3，质谱条件：

离子源为电喷雾离子源，接口电压为4KV，接口温度为300℃，DL温度为250℃，加热块温度为400℃，雾化气流量为3L/min，干燥气流量为10L/min，加热气流量为10L/min，去簇电压分别为-18eV的利福平和-27eV的利福平-d3；Q1 Pre偏差分别为-24V的利福平和-24V的利福平-d3；Q3 Pre偏差分别为-40V的利福平和-28V的利福平-d3；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测。

S4，高效液相色谱-串联质谱仪测定：

取适量测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，测试样品中的利福平和内标利福平-d3的色谱峰，并计算所述血浆样品中的利福平的浓度。

其中，用于定量分析的离子反应分别为：m/z 823.3→791.30，其为利福平；m/z826.10→402.10，其为利福平-d3。