[发明专利]一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法

权利要求书

1.一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1，血浆样品预处理：

以K2-EDTA为抗凝剂，以利福平-d3为内标；于96深孔板中精密加入50μL的血浆样品，加入50μL的1μg/mL的内标利福平-d3溶液，混匀后加入200μL有机溶剂甲醇于96深孔板中，涡旋混合；于4℃以4200rpm离心10min，取上层清液50μL至装有300μL混合有机溶剂的96深孔板中；水按照体积比50：50混合得到的混合物，涡旋混匀；于4℃以4200rpm离心10min后作为测试样品待检测；以上过程中除了离心均需于室温黄光条件下操作；

S2，液相色谱条件：

Welch Μltimate XB-C18，5μm，柱规格为2.1x100mm；色谱柱温：40℃；流动相A：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相B：乙腈；洗液：乙腈/水/甲酸的体积百分比为80/20/0.1；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为5μL，分析时间4.0min；

S3，质谱条件：

离子源为电喷雾离子源，接口电压为4KV，接口温度为300℃，DL温度为250℃，加热块温度为400℃，雾化气流量为3L/min，干燥气流量为10L/min，加热气流量为10L/min，去簇电压分别为-18eV的利福平和-27eV的利福平-d3；Q1 Pre偏差分别为-24V的利福平和-24V的利福平-d3；Q3 Pre偏差分别为-40V的利福平和-28V的利福平-d3；正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测；

S4，高效液相色谱-串联质谱仪测定：

取适量测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，测试样品中的利福平和内标利福平-d3的色谱峰，并计算所述血浆样品中的利福平的浓度；

其中，用于定量分析的离子反应分别为：m/z 823.3→791.30，其为利福平；m/z 826.10→402.10，其为利福平-d3。

2.根据权利要求1所述的高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法，其特征在于：进一步地，所述梯度洗脱选用二元高压梯度洗脱，所述二元高压梯度洗脱程序为：

3.根据权利要求1所述的高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法，其特征在于：所述步骤S4中，采用内标法，以利福平和内标利福平-d3的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的利福平的浓度。

4.根据权利要求3所述的高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法，其特征在于：所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：取190μL空白血浆10份置于聚丙烯管中，以贮备液的形式分别添加10μL浓度分别为0.2μg/mL、0.4μg/mL、1.0μg/mL、4.0μg/mL、12μg/mL、24μg/mL、48μg/mL、60μg/mL的利福平工作溶液至标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、最高定量上限样本中，分别添加50μL体积分数为50％的甲醇水溶液至双空白样本中，混匀后分别向标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、最高定量上限样本、零浓度样本中加入50μL的1μg/μL的内标利福平-d3溶液，向双空白样本中加入50μL的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后分别向10份样本中加入200μL甲醇于96深孔板中，涡旋混合，于4℃以4200rpm离心10min，取上层清液50μL至装有300μL混合有机溶剂的96深孔板中，混合有机溶剂为甲醇：水按照体积比50：50混合得到的混合物，涡旋混匀，于4℃以4200rpm离心10min后分别作为10份标准样品待检测；以上过程中除了离心均需于室温黄光条件下操作；分别取适量标准样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中的利福平和内标利福平-d3的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆样品中的利福平的浓度。