[发明专利]一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法

说明书

本发明公开了一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供了能够在低盐条件下生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌ECT‑LA，该菌以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为基础，包含由T7启动子控制的四氢嘧啶合成基因簇ectABC及外源基因lysC^C932T和asd，并优化了四氢嘧啶的制备方法。本发明构建的重组大肠杆菌以葡萄糖为底物，分批补料发酵56h后，四氢嘧啶产量可达60g/L。

技术领域

本发明涉及一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

四氢嘧啶(Ectoine)又称依可多因，属于天冬氨酸衍生物，作为一种相容溶质，可以协助细胞维持胞内外的渗透压平衡；与蛋白质、核酸等大分子以及细胞膜相互作用以提高其稳定性，提高细胞承受高温、高盐度、高酸碱度、射线等极端环境的能力，已广泛应用于新型化妆品、药物、皮肤创伤修复以及器官移植维持等领域。

四氢嘧啶可以通过中度嗜盐菌以“细菌挤奶”的方法生产，但这种工艺依赖高盐胁迫的诱导，发酵周期长、提取困难且产量低，且不利于设备维护，同时由于四氢嘧啶的手性结构等问题，导致化学合成四氢嘧啶的难度与成本增加。为满足日益增加的工业需求，构建系统代谢工程菌株以高产四氢嘧啶成为研究热点，大肠杆菌作为目前微生物发酵工业中应用最广泛的菌株成为重要选择。谢希贤等(201510410080.2)通过构建具有特定基因型的E.coli W3110，包含来源于伸长盐单胞菌ectABC基因；lysA、thrA、iclR三个基因缺陷型；具有lac启动子控制的谷氨酸棒状杆菌lysC基因；trc启动子控制的ppc基因，葡萄糖为底物发酵20-28h后，四氢嘧啶产量达12-18g/L，但关键支路途径导致氨基酸缺陷型，一定程度上会抑制菌体生长，给菌体造成一定的压力，进而影响四氢嘧啶的生产。王鸿等(201810996222.1)通过构建具有特定基因型的E.coli MG1655，包括伸长盐单胞菌ectABC基因；lysA基因缺陷型，L天冬氨酸钠为底物，全细胞转化法合成四氢嘧啶，2030h产量达2.53.5g/L，但全细胞催化法发酵工艺复杂，成本高。以上两种大肠杆菌生产四氢嘧啶工艺产量不高，大大影响了四氢嘧啶相关研究进展以及商业应用的推进。

发明内容

本发明利用合成生物学技术和基因工程的手段，以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)做为出发菌株，表达伸长盐单胞菌来源四氢嘧啶合成途径相关基因簇ectABC，实现四氢嘧啶的异源合成；并通过组合表达谷氨酸棒杆菌来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc、谷氨酸棒杆菌来源的丙酮酸羧化酶基因pyc、铜绿假单胞菌来源的天冬氨酸脱氢酶基因aspDH、谷氨酸棒杆菌来源并解除反馈抑制的天冬氨酸激酶基因lysC^C932T、伸长盐单胞菌来源的天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd、枯草芽孢杆菌来源的谷氨酸脱氢酶基因rocG，获得了四氢嘧啶产量提高的重组大肠杆菌。

本发明提供了一种生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，表达了伸长盐单胞菌来源的四氢嘧啶合成基因簇ectABC，所述四氢嘧啶合成基因簇ectABC包括二氨基丁酸转乙酰基酶基因ectA、二氨基丁酸转氨酶ectB和四氢嘧啶合成酶ectC，并表达了(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)中至少一种基因；其中：

(a)谷氨酸棒杆菌来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc；

(b)谷氨酸棒杆菌来源的丙酮酸羧化酶基因pyc；

(c)铜绿假单胞菌来源的天冬氨酸脱氢酶基因aspDH；

(d)谷氨酸棒杆菌来源的天冬氨酸激酶基因lysC；

(e)伸长盐单胞菌来源的天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd；

(f)枯草芽孢杆菌来源的谷氨酸脱氢酶基因rocG。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌含有双质粒表达系统；所述双质粒包括pRSFDuet-1和pACYCDuet-1。