[发明专利]一种基于高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测生物样本中口服抗凝血药含量的方法

说明书

本发明提供了一种基于高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测生物样本中口服抗凝血药含量的方法，涉及临床生物样本检测技术领域。所述方法包括：(a)标准品溶液的配制；(b)内标液的配制；(c)生物样本的预处理；(d)在混合内标工作液中分别加入生物样本、标准品溶液、质控品工作液混合后离心，然后取上清液进行高效液相色谱三重四级杆串联质谱；使用的分析色谱柱为C18色谱柱，以流动相A和流动相B混合进行梯度洗脱；所述流动相A为含有0.1～0.5％甲酸水溶液；流动相B为0～0.5％甲酸甲醇溶液。本发明方法实现了一次性检测生物样本中多种口服抗凝血药的含量，简单高效。

技术领域

本发明涉及临床生物样本检测技术领域，尤其是涉及一种基于高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测生物样本中口服抗凝血药含量的方法。

背景技术

口服抗凝血药物(NOACs)如达比加群、利伐沙班、阿哌沙班、艾多沙班等通常为固定剂量，且没有常规凝血功能监测。现有临床研究已证实NOACs的疗效至少与维生素K拮抗剂相当，但严重出血事件更少，特别是颅内出血显著更少。这使得无需对出血事件进行监测从而简化了抗凝治疗。NOACs的这种优势以及经过验证的疗效和安全性，可以解释为什么在房颤的卒中预防和静脉血栓栓塞治疗中，与维生素K拮抗剂相比，指南优先推荐NOAC。

尽管不需要常规监测凝血功能，但仍迫切需要可简单快速检测NOACs的方法。随着昂贵的逆转剂例如达比加群逆转剂艾达赛珠单抗(idarucizumab)、利伐沙班/阿哌沙班/依度沙班逆转剂andexanet alfa的引入，这种需求将逐渐增加。

当前活化部分凝血活酶时间(aPTT)、凝血酶原时间(PT)是评估达比加群和一些口服凝血因子Xa抑制剂的有价值的指标，但这些检测方法的灵敏度是差别很大，不同药物灵敏度不同。不仅同一个实验室的测试结果解释非常复杂，而且不同实验室之间比较也很困难。这些问题突显出标准化检测的必要性。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测生物样本中口服抗凝血药含量的方法，所述方法实现了一次性检测生物样本中多种口服抗凝血药的含量，简单高效。

本发明提供的技术方案如下：

一种基于高效液相色谱三重四级杆串联质谱检测生物样本中口服抗凝血药含量的方法，所述方法包括：

(a)标准品溶液的配制：使用50％～90％甲醇水溶液将标准品储备液配制成混合标准品工作液；将所述混合标准品工作液配制成浓度0.2-50μg/mL的标准品溶液；

(b)内标液的配制：使用蛋白质沉淀剂稀释同位素内标物储备液，配制成浓度为5～50ng/mL的混合内标工作液；

(c)生物样本的预处理：

(d)吸取混合内标工作液于96孔蛋白沉淀板，分别加入生物样本、标准品溶液、质控品工作液混合后，静置，放置在96孔负压装置上，抽滤，然后取上清液进行高效液相色谱三重四级杆串联质谱；使用的分析色谱柱为C18色谱柱，以流动相A和流动相B混合进行梯度洗脱；所述流动相A为含有0.1～0.5％甲酸水溶液；流动相B为0～0.5％甲酸甲醇溶液。

在一个实施方案中，所述梯度洗脱的洗脱程序为：

0.2min时，流动相B15％；

0.5～0.8min时，流动相B 70％；

1.00～1.50min时，流动相B升至90％；

1.51min时，流动相B15％；

4min时，流动相B15％。

本发明的色谱流动相体系的选择结合特定的洗脱程序，可以提高信噪比，使得达比加群、利伐沙班、阿哌沙班和艾多沙班的出峰更明显。