[发明专利]一种基因工程菌株生物催化生产L-苯甘氨酸的方法

说明书

本发明涉及一种基因工程菌株生物催化生产L‑苯甘氨酸的方法，该方法包括：将编码L‑α‑氨基酸脱氨酶的基因、编码羟基扁桃酸合成酶的基因和载体通过酶切连接，得到第一重组质粒；将编码扁桃酸脱氢酶的基因、编码亮氨酸脱氢酶的基因和载体通过酶切连接，得到第二重组质粒；将所述第一重组质粒和所述第二重组质粒共同转入宿主细胞中，得到基因工程菌。根据本发明实施例，该方法获得的基因工程菌生物催化L‑苯丙氨酸，可使L‑苯甘氨酸达最大收率，具有广阔的工业化应用前景。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种基因工程菌株生物催化生产L-苯甘氨酸的方法。

背景技术

L-苯甘氨酸是一种手性非天然氨基酸，作为一种重要的原料化合物和药物中间体，可用于合成青霉素、维及霉素、普那霉素I等β-内酰胺类抗生素，也可用于抗肿瘤药物紫衫醇的合成，在医药领域具有广阔的市场前景。L-苯甘氨酸主要通过化学法合成，但化学合成反应条件剧烈、工艺复杂、副产物较多、产品光学纯度较低，需要进一步光学拆分；且合成过程中需要用到大量的有机溶剂和有毒物质，工业污染严重。

相比化学合成，生物合成具有选择性强、反应条件温和、环境友好及对设备要求低等优势，随着环境问题日益突出，绿色、环保的生物合成更受关注和青睐。因此，后续也出现了一些利用苯海因酶转化法、D-苯甘氨酸氨基转移酶法和氨基酸脱氢酶法等生物合成苯甘氨酸的报道。然而，它们仍存在一定的缺陷，例如需要硫酸的辅助、催化活性低或需要额外的辅酶循环系统等。因此，目前亟待开发一条转化效率高、对应选择性好、成本低廉并且环境友好的L-苯甘氨酸制备路线。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种基因工程菌生物催化生产L-苯甘氨酸的方法。该方法可实现以L-苯丙氨酸为底物，生物催化高效合成L-苯甘氨酸，具有广阔的工业化应用前景。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种构建生产L-苯甘氨酸的基因工程菌的方法，其包括以下步骤：

将编码L-α-氨基酸脱氨酶的基因、编码羟基扁桃酸合成酶的基因和载体通过酶切连接，得到第一重组质粒；

将编码扁桃酸脱氢酶的基因、编码亮氨酸脱氢酶的基因和载体通过酶切连接，得到第二重组质粒；

将所述第一重组质粒和所述第二重组质粒共同转入宿主细胞中。

根据本发明实施例的构建生产L-苯甘氨酸的基因工程菌的方法，该方法通过构建共表达L-α-氨基酸脱氨酶(L-α-amino acid deaminase,LAAD)和羟基扁桃酸合成酶(hydroxymandelate synthase,HmaS)的质粒，共表达扁桃酸脱氢酶(mandelatedehydrogenase，SMDH)和亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase LeuDH)的质粒，并将两质粒同时转入宿主细胞中，获得重组菌株，该重组菌株以L-苯丙氨酸为底物，级联催化后生产接近100％收率的L-苯甘氨酸。

可选地，所述第一重组质粒是以pET系列载体为表达载体，例如，pETDuet-1；所述第二重组质粒是以pRSF系列载体为表达载体，例如，pRSFDuet-1。

可选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

在本发明的第二个方面，本发明提出了由上述方法构建的生产L-苯甘氨酸的基因工程菌。该基因工程菌以L-苯丙氨酸为底物，级联催化后生产接近100％收率的L-苯甘氨酸。

在本发明的第三个方面，本发明提出一种表达上述基因工程菌的方法，其包括将基因工程菌先接种于LB培养基中，过夜培养，之后按1:100比例将过夜培养物转接入TB培养液中培养2～3h，再加入诱导剂进行诱导培养16～24h。