[发明专利]一种细胞表面展示酸性蛋白酶的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种细胞表面展示酸性蛋白酶的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。一种细胞表面展示酸性蛋白酶的酿酒酵母工程菌的构建方法，将密码子优化后的酸性蛋白酶编码基因插入到酿酒酵母表面展示表达载体PUC‑GAP‑α‑factor‑SED1中，将所述重组载体转化转入宿主菌株酿酒酵母中，得到细胞表面展示酸性蛋白酶的酿酒酵母工程菌。本发明制备的酿酒酵母工程菌不仅能使酸性蛋白酶在生产的同时实现固定化，而且异源表达不会造成酸性蛋白酶的空间结构受其他物理或化学因素破坏，制得的固定化酶活力和产量均较理想，可作为全细胞催化剂应用于催化蛋白质水解中的应用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种细胞表面展示酸性蛋白酶的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

酸性蛋白酶是蛋白酶中的天冬氨酸蛋白酶，在酶的活性位点中心含有一个或更多的羧基，普遍分布于植物、真菌和哺乳动物中。酸性蛋白酶能够在酸性介质(pH5.0)中有效地水解蛋白质。反应底物被彻底水解为氨基酸和小肽链的过程，通常依靠蛋白酶的水解作用即内切和外切作用，同时这类酶具有极强的耐酸性，在蛋白质水解过程中不会因微生物的滋生繁殖而腐败变质，普遍被应用于食品，酿造，医药，轻工等各个工业中。鉴于产生酸性蛋白酶的微生物来源不同，酸性蛋白酶大致可被分为三大类。工业生产中分泌酸性蛋白酶的菌株主要是黑曲霉和米曲霉，对于真菌微生物而言，一种菌株通常可以分泌一种或多种酸性蛋白酶，两种不同的酸性蛋白酶可以由黑曲霉的突变体产生，即酸性蛋白酶A和酸性蛋白酶B。两种蛋白酶的活性位点组成不同，酸性蛋白酶B的活性位点具有天冬氨酸残基，酸性蛋白酶A则不存在天冬氨酸残基。在酸性蛋白酶的丰富性和复杂性程度上，真菌分泌产生的酸性蛋白酶相较于其他类型酸性蛋白酶具有更大的潜力。蛋白质被催化水解产生多肽和氨基酸依赖于蛋白酶的作用。蛋白酶可依据活性位点上官能团的差异，通常被分为四种类型：含硫类氨基酸Cys的蛋白酶，富含羟基类氨基酸Ser的蛋白酶，富含酸性氨基酸Asp的蛋白酶和金属蛋白酶。对于天冬氨酸(Asp)蛋白酶而言，其等电点大致为3.0～5.0，且分子量大约是30～40千道尔顿，最大的酶活性体现位于酸性介质中，因此被称为酸性蛋白酶，这是一种极具有丰富的化学和物理性质的化合物。

酶的固定化一般都是通过物理或化学的方法将游离酶固定于特殊的载上，不仅增强酶的稳定性，同时又能使酶与作用底物分离，达到重复利用，降低成本的目的。但是，传统的物理或化学固定化方法，增加的酶固定化操作会导致酶活性和回收率的损失；另外，固定化需用特殊的载体材料，对固定化技术要求比较高，因而增加了载体制作和固定化操作的成本费用，被固定的酶分离纯化同样增加了生产成本。

而近些年发展起来的微生物细胞表面展示技术为酶的固定化提供了一种全新的基于基因重组技术的生物学方法。酿酒酵母一直被认为是安全的模式生物(GRAS)而广泛应用于食品和医药工业，也是目前常见的用于酵母表面展示的宿主细胞。利用细胞表面展示技术将具有高催化活性的酶展示表达于酿酒酵母细胞表面就形成了全细胞催化剂，与传统的细胞内酶和外分泌酶不同，表面展示的酶是以共价或非共价的方式固定于细胞外表面，这种独特的空间定位使其相对游离酶而言有许多优良的特性，如温度、有机溶剂稳定性、可多次重复利用等，这些特点与传统的固定化酶技术类似，但无需额外制备载体及固定化、酶蛋白分离纯化等复杂操作，有着巨大的应用前景。然而，异源蛋白过量表达却会导致生长胁迫压力引起未折叠蛋白效应(UPR)，导致酸性蛋白酶的产量不能进一步提高，一定程度上限制了酸性蛋白酶的工业化生产。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种细胞表面展示酸性蛋白酶的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用，使酸性蛋白酶在细胞表面固定同时其空间结构不受破坏，保证固定化酶的活力和产量均较高。

本发明提供了一种细胞表面展示酸性蛋白酶的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1)将密码子优化后的酸性蛋白酶编码基因插入到酿酒酵母表面展示表达载体PUC-GAP-α-factor-SED1中，得到重组载体；