[发明专利]一种改造的酸性磷酸酶及其应用

说明书

本发明公开了一种改造的酸性磷酸酶及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种改造的酸性磷酸酶PaAPasemu3，通过在大肠杆菌中表达所述改造的酸性磷酸酶PaAPasemu3，利用全细胞转化法，将维生素C转化为维生素C磷酸酯。并从反应的pH、温度方面对改造的酸性磷酸酶PaAPasemu3的催化体系进行优化，可使得维生素C磷酸酯产量达到90.1 g/L，摩尔产率达75.1％。从而大大降低了之前的底物成本和环境污染等问题，为维生素C磷酸酯的工业化生产和绿色生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种改造的酸性磷酸酶及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

维生素C磷酸酯作为一个维生素C的衍生物，其化学式为C₆H₆O₉P。它是由维生素C的碳骨架在2位桥连一个磷酸基。

目前，维生素C磷酸酯的主要生产方法为化学合成法，主要为基团保护法合成，但是这种方法虽然得率高，能耗却较大，同时会对环境产生毒害作用，不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。通过生物法制备维生素C磷酸酯具有产品质量稳定安全、工艺条件温和、高效、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，因此迫切需要一种有效的生物法高效制备维生素C磷酸酯。

目前，微生物法生产维生素C磷酸酯涉及到一个关键的酶酸性磷酸酶，它具有广泛的底物谱，可以催化维生素C，使其C2位磷酸化，形成维生素C磷酸酯。而微生物法制备维生素C磷酸酯主要为酶转化法。目前，由于酶转化法具备环境友好、反应条件温和及操作简便等优点而更具备工业应用价值。但是，天然筛选的酸性磷酸酶本身存在水解能力，会水解产物，导致维生素C磷酸酯的产率低下，限制了酶转化法大规模生产制备，提高酶酸性磷酸酶的磷酸化能力，减弱水解能力是目前研究的重点问题。

发明内容

在目前的研究中，酸性磷酸酶都会对产物进行水解，导致产量低。因而，为实现磷酸化反应，酶改造的酸性磷酸酶往往需要对特定的关键残基进行突变改造的，以期来提高酶的实用性能。

本发明提供了酸性磷酸酶突变体，以来源于Pseudomonas aeruginosa的酸性磷酸酶为亲本酶，所述酸性磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，将亲本酶的第57位、第58位、第94位和第135位中的至少一个位点突变。

在一种实施方式中，所述突变体为(a)-(f)所示任一：

(a)第58位突变为F；

(b)第94位突变为F；

(c)第135位突变为R；

(d)第94位突变为F、第135位突变为R；

(e)第58位突变为P、第135位突变为R；

(f)第57位突变为H、第58位突变为P、第135位突变为R。

本发明提供了编码所述突变体的基因。

本发明提供了携带所述基因的重组质粒。

本发明提供了表达所述突变体，或携带所述重组质粒的微生物细胞。

本发明提供了一种合成维生素C磷酸酯的方法，利用所述微生物细胞以维生素C为底物，转化生产维生素C磷酸酯。

在一种实施方式中，将所述微生物细胞加入含有维生素C和焦磷酸钠的反应体系，反应体系中的pH为3.8-4.3。

在一种实施方式中，反应体系中的pH为4.0-4.2。

在一种实施方式中，在25-37℃下反应不少于8小时。

在一种实施方式中，在25-30℃下反应不少于10小时。