[发明专利]基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于CRSIPR技术构建14‑3‑3ε基因敲除细胞株的方法及其应用，属于生物技术领域。本发明提供一种敲除14‑3‑3ε基因的sgRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明利用CRISPR‑Cas9技术首次在鸡成纤维细胞系DF‑1细胞基因组上敲除14‑3‑3ε基因，使得14‑3‑3ε蛋白的表达完全丧失，获得14‑3‑3ε敲除的DF‑1细胞株，且敲除细胞株活性、生长速度等方面均与对照细胞无明显差异，是较为理想的DF‑1敲除的细胞模型；操作简便，周期短，成本低，改造后细胞株稳定，可用于研究14‑3‑3ε蛋白的生物学功能。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法及其应用。

背景技术

14-3-3蛋白在大多数动植物中高度保守，哺乳动物细胞中有7种14-3-3蛋白亚型(β、γ、ε、σ、ζ、τ和η)。14-3-3家族的每个同工型可以形成同型或异型二聚体，作为分子伴侣蛋白主要结合磷酸化蛋白，并在受到刺激后调节其靶蛋白的细胞亚定位，从而调控如干扰素反应和细胞凋亡等多种细胞重要生理过程。研究显示，寨卡病毒NS3蛋白通过结合并隔离14-3-3ε与14-3-3η蛋白，以拮抗视黄酸诱导基因1(retinoicacidinduciblegene-1,RIG-1)和黑色素瘤分化相关分子(MDA-5)诱导的干扰素反应。抑制14-3-3ε蛋白的表达后，丙肝病毒和仙台病毒诱导的磷酸化干扰素调节因子3(Interferon regulatory Factor 3,IRF-3)减少，阻碍干扰素反应。丙肝病毒核心蛋白可以与14-3-3ε相互作用，调控Raf-1激酶活性并调节线粒体中BAX的释放，从而控制宿主细胞的信号转导和凋亡。使用14-3-3的抑制剂Difopein TFA或siRNA干扰14-3-3ε后能够抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)复制，过表达14-3-3ε导致HP-PRRSV复制增加。不难发现，14-3-3ε蛋白与多种病毒的感染致病过程密切相关，是今后研究病毒致病机制的一个重点。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出的特有免疫系统～CRISPR系统。利用这个系统，细菌可以把病毒基因从自己的染色体上切除。近年来，科学家们从细菌中解析了这个系统的关键蛋白(Cas9)，并掌握了这个关键蛋白的操作技术。以该关键蛋白为核心的复合物能在一段RNA的指导下，定向寻找目标DNA序列，然后编辑DNA以扰乱基因或插入想要的序列。CRISPR方法正快速超越锌指核酸酶和其他编辑工具，能够快速的对生物DNA序列进行修剪、切断、替换或添加，且操作简单，成本低廉。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺点与不足，本发明的第一个目的在于提供一种敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列。

本发明的第二个目的在于提供一种基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法。

本发明的第三个目的在于提供一种14-3-3ε基因敲除细胞株。

本发明的第四个目的在于提供上述14-3-3ε基因敲除细胞株的应用。

本发明的目的通过如下方法制备得到：

一种敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列，其核苷酸序列为：5'-GGTTGAATCAATGAAGAAAG-3'。

一种基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法，包括如下步骤：

(1)根据上述敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列，在其5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸链，同时根据上述靶向敲除人P300基因的sgRNA序列获得其对应的DNA互补链，在其5'端加上AAAC、3'端加上C得到反向寡核苷酸链，将合成的正向寡核苷酸链和反向寡核苷酸链变性、退火形成双链；