[发明专利]基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法及其应用有效
| 申请号： | 202110386494.1 | 申请日： | 2021-04-12 |
| 公开（公告）号： | CN113186187B | 公开（公告）日： | 2023-03-17 |
| 发明（设计）人： | 任涛;张殿宸;梁健鹏;向斌;林秋燕 | 申请（专利权）人： | 华南农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/85;C12N15/12;C12N5/10 |
| 代理公司： | 广州市华学知识产权代理有限公司 44245 | 代理人： | 苏运贞 |
| 地址： | 510642 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 crsipr 技术 构建 14 基因 细胞株 方法 及其 应用 | ||
1.一种基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)根据敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列，在其5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸链，同时根据所述的敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列获得其对应的DNA互补链，在其5'端加上AAAC、3'端加上C得到反向寡核苷酸链，将合成的正向寡核苷酸链和反向寡核苷酸链变性、退火形成双链；
(2)将步骤(1)制得的双链与Cas9载体连接，得到重组敲除表达载体；
(3)将步骤(2)制得的重组敲除表达载体使用脂质体转染法转染鸡成纤维细胞系DF-1细胞，培养，筛选稳转细胞，得到14-3-3ε基因敲除细胞株；其中，
步骤（1）中敲除14-3-3ε基因的sgRNA的核苷酸序列为：5'-GGTTGAATCAATGAAGAAAG-3'；
步骤(2)中所述的Cas9载体为PX459载体；
步骤(4)中所述的筛选为嘌呤霉素筛选，筛选的操作为培养48 h后，先用含0.5 μg/mL嘌呤霉素的新鲜10% FBS的DMEM细胞培养液培养24 h，然后更换为含1 μg/mL嘌呤霉素的新鲜10% FBS的DMEM细胞培养液，继续培养24 h以实现嘌呤霉素筛选。
2.根据权利要求1所述的基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的脂质体转染法所用的脂质体为Lipofectamine 2000。
3.根据权利要求1所述的基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的DF-1细胞为处于对数生长期的细胞DF-1细胞。
4.一种14-3-3ε基因敲除细胞株，其特征在于：通过权利要求1-3任一项所述的方法制备得到。
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