[发明专利]抗原结合域自动优化的嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建、筛选方法及其应用

权利要求书

1.一种抗原结合域自动优化的嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，将包含第一基因元件、第二基因元件、第三基因元件、第四基因元件以及第五基因元件的载体转染至细胞内，所述载体为一个或多个，即得到嵌合抗原受体修饰细胞文库；

所述第一基因元件为编码受体1的核苷酸序列，所述受体1包括胞外域，跨膜域及胞内域；所述胞外域可识别靶标抗原上所标记的生物素或6×His标签，所述胞内域包括烟草蚀纹病毒蛋白酶TEVP；

所述第二基因元件为编码受体2的核苷酸序列，所述受体2包括胞外抗原结合域、跨膜域以及胞内信号域；所述抗原结合域为抗体序列动态库，所述动态库是在第四基因元件的作用下诱导产生一系列突变，引入序列多样性所得；所述胞内信号域包括tTA转录因子结构域以及连接序列，所述连接序列连接tTA转录因子结构域和跨膜域，包含TEVP可识别切割的序列；

所述第三基因元件为编码筛选基因的核苷酸序列，tTA转录因子可以启动所述筛选基因的表达，使宿主产生荧光、获得某种抗性、或者获得在某种条件下的生长优势；

所述第四基因元件为编码一种或多种顺式调控元件和一种或多种反式作用因子的核苷酸序列；所述顺式调控元件能够使DNA产生特殊结构的DNA序列，所述特殊结构是指DNA结构中含有未发生碱基互补配对的DNA单链结构，所述的特殊结构包括R-loop，G-三联体以及G-四联体；所述反式作用因子为Cas蛋白家族及Cas蛋白家族的变体、gRNA、尿嘧啶糖基化酶抑制剂、腺嘌呤脱氨酶、胞苷脱氨酶、RNA-DNA杂合链结合蛋白、感光蛋白、Nucleolin、DNA解旋酶、易错DNA聚合酶、重组酶、核酸内切酶、核酸外切酶、烷基腺嘌呤糖基化酶中的一种或多种的组合；

所述第五基因元件为编码抑制系统的核苷酸序列，tTA转录因子可以启动所述抑制系统的表达，进而敲减或敲除反式作用因子，使抗体序列动态库维持稳定；或所述第五基因元件为编码光控制系统的核苷酸序列，所述光控制系统能够调控第四基因元件的表达：在光照条件下启动第四基因元件发挥作用，开始构建抗体动态序列库；停止光照后，第四基因元件功能被抑制，使抗体动态序列库维持稳定。

2.根据权利要求1所述嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，所述细胞为人源或鼠源细胞。

3.根据权利要求1所述嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，所述抗体序列动态库包括传统抗体库、单链抗体库及纳米抗体库。

4.根据权利要求1所述嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，所述受体1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求1所述嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，所述受体2是由Notch受体改造而来的synNotch受体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求1所述嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，所述反式作用因子包括以下Cas蛋白家族成员及其部分结构域：Cas3-8s、Cas10s、Cas11s、Cas9s、xCas9、Cas12s、Cas13s和Cas14s。

7.根据权利要求1所述嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，所述反式作用因子包括以下腺嘌呤脱氨酶及其部分结构域：ecTadA、mADA、hADAR2和hADAT2。

8.根据权利要求1所述嵌合抗原受体修饰细胞文库的构建方法，其特征在于，所述反式作用因子包括以下胞苷脱氨酶及其部分结构域：AID(activation-induced cytidinedeaminase)、APOBEC3G、APOBEC1和CDA1。