[发明专利]一种病毒VP2蛋白分离纯化的规模化生产方法

说明书

一种病毒VP2蛋白分离纯化的规模化生产方法，属于生物制品技术领域。为解决利用大肠杆菌表达传染性法氏囊VP2蛋白生产鸡传染性法氏囊病疫苗会产生内毒素的问题，本发明提供了一种病毒VP2蛋白分离纯化的规模化生产方法，该方法为将大肠杆菌破碎后，加入一定比例的脱氧胆酸钠，然后加入有机磷酸盐缓冲液作为螯合剂，调节适当的pH，同时在溶液中加入一定浓度的NaCl，充分混匀后，利用中空纤维柱的切向流过滤功能，将内毒素单体去除。本发明所述生产方法既能生产出高浓度的法氏囊VP2蛋白，又能符合新版兽药GMP生产要求，具备低生产成本的特点。

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及的是一种病毒VP2蛋白分离纯化的规模化生产方法。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease virus,IBDV)引起的一种急性、高度传染性的免疫抑制性疾病。IBDV主要结构蛋白VP2含有血清型特异性、能诱导中和抗体产生的构象依赖型抗原决定簇,其诱导的中和抗体能被动地保护宿主不受IBDV的感染,是IBDV的主要保护性抗原,具有特异性,因而成为制备法氏囊病基因工程亚单位疫苗的主要蛋白。现有技术常利用能够表达传染性法氏囊病病毒的VP2基因的大肠杆菌生产VP2蛋白，进而生产鸡传染性法氏囊病疫苗。该方法获得法氏囊VP2蛋白需要先将大肠杆菌破碎，而大肠杆菌破碎不可避免的产生大量的内毒素，内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。内毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的黏肽上。各种细菌的内毒素的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。因此如果不将内毒素降低到一定范围，就会对接种疫苗的动物产生(严重)副反应。

为了将大肠杆菌破碎产生的内毒素控制在一定的范围内，就需要对法氏囊VP2蛋白进行分离纯化。现在去除内毒素最常用也最有效的方式就是层析方法，但这种方法就是需要特殊的填料，而这种填料的成本也比较昂贵，已经超出禽用疫苗的生产成本范围。还有一种价格相对低廉的萃取方式，但这种方式需要反复的离心，离心过程中的一些操作方式有可能不符合新版的GMP规范要求。因禽用疫苗市场售价低廉，需控制生产成本，疫苗品质必须保证，既要对蛋白进行高浓度提纯，又要控制纯化过程中的成本，这就增加了后续分离纯化的难度。因此，急需一种既能高浓度提纯法氏囊VP2蛋白，又能降低生产成本的法氏囊VP2蛋白的分离纯化的规模化生产方法。

发明内容

本发明为解决利用大肠杆菌表达传染性法氏囊VP2蛋白生产鸡传染性法氏囊病疫苗会产生内毒素的问题，提供了一种符合生产成本要求和GMP规范的病毒VP2蛋白分离纯化的规模化生产方法，具体生产方法如下：

步骤一、表达法氏囊病病毒的VP2基因的大肠杆菌菌体经裂解液重悬、高压匀质机破碎及离心后获得菌液；

步骤二、将步骤一获得的菌液放入超滤孔径的中空纤维柱中，在封闭透出端后，进行反复冲刷，然后打开透出端，调整流速，将柱内体积浓缩至原体积的1/5-1/10后关闭透出端；

步骤三、向柱内加入等体积的PB缓冲液，关闭透出端，柱内循环15min-30min，打开透出端，将菌液体积再次浓缩至加入缓冲液之前的体积，然后用PB缓冲液对菌液进行连续洗滤，直至透出端废液体积达到罐内液体体积的4-8倍；

步骤四、向步骤三获得的菌液中加入等体积的含有脱氧胆酸钠和氯化钠的混合液，调节pH至7.0-7.5，关闭透出端阀门，柱内循环15min-30min，然后用含有脱氧胆酸钠和氯化钠的PB缓冲液对菌液进行连续洗滤，直至透出端废液体积达到罐内液体体积的5-10倍完成整个工艺流程。

进一步地限定，步骤一所述裂解液为0.1mol/L-0.3mol/L的PB缓冲液，大肠杆菌菌体湿菌重与裂解液的体积比为1:10。