[发明专利]一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法

说明书

本发明提供了一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，涉及动物模型构建技术领域。本发明所述sgRNAs分别设计在Pax2基因的intron1和intron2非保守区中，5'端和3'端的同源臂分别约为1.4kb和1.4kb。本发明基于上述sgRNA设计了Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，将Cas9/sgRNA质粒和所述特异性打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，通过两步筛选和一次杂交，获得Pax2条件性基因敲除小鼠模型，运用cre‑loxp系统，构建出flox小鼠后可与不同的cre工具鼠灵活搭配运用，研究目的基因在不同组织器官，甚至不同细胞类型中的作用机制。

技术领域

本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法。

背景技术

Pax为全长配对盒基因，属于发育调控基因家族，在胚胎发育过程中，可通过编码核转录因子，达到促进组织增生、抑制细胞凋亡和协调细胞的特殊分化的作用。近年来发现与核转录因子有关的Pax家族中的Pax2在免疫组织化学中具有明显的应用，如Pax2同源基因在肾脏的分化过程中表现出强表达，特别是后肾间叶细胞，是间叶细胞向上皮细胞转化的关键因素；同时关于Pax2基因的致瘤性在体外和裸鼠体内试验中也有报道，Pax2在体外肾癌的细胞株上表达，在卵巢浆液性乳头状瘤中也有较高表达。但是目前关于Pax2的作用机理并不深刻，且也没有相关的动物模型进行相关的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向小鼠Pax2基因的sgRNA及Pax2条件性基因敲除模型的构建方法，可成功构建Pax2条件性基因敲除小鼠模型，运用cre-loxp系统，构建出flox小鼠后可与不同的cre工具鼠灵活搭配运用，研究目的基因在不同组织器官，甚至不同细胞类型中的作用机制，为国内外提供有效的模型动物。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种靶向小鼠Pax2基因的sgRNA，所述sgRNA包括5’Guide序列和3’Guide序列，所述5’Guide包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的任意一条序列；所述3’Guide序列包括SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16所示的任意一条序列。

优选的，所述sgRNA的5’Guide序列如SEQ ID NO.5所示，且所述sgRNA的3’Guide序列如SEQ ID NO.10所示。

优选的，所述小鼠Pax2基因在NCBI的Gene ID为18504。

本发明提供了一种Pax2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：(1)以小鼠基因组DNA为模板，分别克隆小鼠Pax2基因的LR、A和RR片段，依次将所述LR、A和RR片段连接至LScKO-2G载体，得特异性打靶载体；克隆所述LR片段的引物包括Pax2-LR-F和Pax2-LR-R，其中所述Pax2-LR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述Pax2-LR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；克隆所述A片段的引物包括Pax2-A-F和Pax2-A-R，所述Pax2-A-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述Pax2-A-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；克隆所述RR片段的引物包括Pax2-RR-F和Pax2-RR-R，所述Pax2-RR-F的核苷酸序列如SEQID NO.21所述，所述Pax2-RR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；

(2)将上述sgRNA合成oligos，连接入pUC载体，得Cas9/sgRNA质粒；

(3)将Cas9/sgRNA质粒和所述特异性打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，出生后得F₀代小鼠；

(4)筛选F₀代小鼠中基因重组正确的个体与野生型小鼠交配得到F₁代小鼠；