[发明专利]一种重组人白介素12蛋白的纯化方法

说明书

本发明提供一种重组人白介素12蛋白的纯化方法。该方法包括：对含有重组人白介素12蛋白的细胞培养液进行澄清过滤预处理；将预处理后获得的细胞液进行复合型强阴离子交换层析，收获的蛋白样品进行复合型弱阳离子交换层析，进一步收获的蛋白样品进行强阳离子交换层析，最终收获得到纯化后的重组人白介素12蛋白。本发明仅采用三次离子交换层析，层析步骤少，三种纯化填料均耐压强、高流速、高分辨率，该方法充分保留了rhIL‑12天然活性，最终可使rhIL‑12蛋白的纯度高达99％以上，宿主蛋白残留量远小于0.05％，宿主DNA含量0.1ng/15μg，细菌内毒素含量符合要求，大大缩短工艺生产时间和成本，适合工业化生产。

技术领域

本发明属于蛋白质纯化技术领域，涉及一种重组人白介素12蛋白的纯化方法。

背景技术

白细胞介素12(Interleukin-12，IL-12)最初根据其生物学基本功能命名为自然杀伤细胞刺激因子(Natural Killer Cell Stimulatory Factor，NKSF)或细胞毒性淋巴细胞成熟因子(Cytotoxic Lymphocyte Maturation Factor，CLMF)，是由活化的单核细胞/巨噬细胞、B淋巴细胞和结缔组织型肥大细胞产生的一种细胞因子。IL-12是一种有效的细胞介导的免疫反应的调节因子，它能诱导NK和T细胞产生IFN-γ，促进NK、CD4+和CD8+细胞的增殖和活化，并诱导可产生IFN-γ的Th1细胞的形成。IL-12是细胞免疫应答过程中的一个初始因子，不仅对T细胞及NK/LAK细胞具有多种促进作用，而且单独或协同IL-2诱导IFN-γ产生，具有抗肿瘤生长以及抗肿瘤转移作用，是一个多功能的免疫活性因子。

人IL-12是一种分子量70kDa的糖蛋白，共503个氨基酸残基，由35kDa的p35(α亚基)和40kDa的p40(β亚基)两个亚基经一对二硫键连接而成的异源二聚体。其中，p35由197个氨基酸组成，含有2对分子内二硫键和1个分子间二硫键，以及3个可能的糖基化位点；p40由306个氨基酸组成，含有3对分子内二硫键和1个分子间二硫键，以及4个可能的糖基化位点。两亚基单独存在时无生物学作用，只有以异二聚体方式结合为后才具有生物学活性。除具生物活性的异二聚体p70外，还能以(p40)2同聚物形式被过量分泌，它是p70天然的拮抗剂，能与p70受体结合从而阻断p70与受体结合发挥生物活性。

IL-12最早是从EBV病毒和佛波酯刺激的人B淋巴母细胞系NC-37的上清液中纯化和鉴定的。由于IL-12是一种糖蛋白，原核表达的IL-12很难具有生物学活性，因此基因工程生产的IL-12是主要利用真核表达系统实现的。从细胞培养物中分离纯化得到一定纯度的具有生物学活性的IL-12蛋白，则是基因工程产品生产过程中非常重要的一个环节。建立简便、廉价、高效而稳定性好的IL-12纯化工艺是临床研究中比较重要的一项工作。

CN101033254A公开了一种纯化人重组白细胞介素12的方法，该方法包括五个步骤：(1)rhIL-12的细胞培养上清液过滤；(2)对步骤(1)所得rhIL-12收集液样品进行阳离子或阴离子交换层析；(3)对步骤(2)所得的rhIL-12收集液进行硫酸铵沉淀；(4)对步骤(3)所得的rhIL-12收集液进行阴离子或阳离子交换层析；(5)对步骤(4)所得的rhIL-12收集液进行分子筛层析，在进行硫酸铵沉淀时所用硫酸铵的pH值远离rhIL-12的等电点。

CN106349384A公开了一种纯化重组白细胞介素12的方法，该方法将重组人白细胞介素12细胞培养液进行预处理，然后经阳离子柱交换层析、硫酸铵分级分离、疏水柱层析、阴离子交换柱层析和凝胶过滤层析处理。

CN1616489A公开了一种纯化重组人白细胞介素12的方法，该方法将重组人白细胞介素12的细胞培养上清液进行阳离子交换层析和阴离子交换层析；然后进行分子尺寸排阻柱层析。