[发明专利]一种基于纳米银介导的可视化定量检测大肠杆菌的方法

说明书

本发明公开了一种基于纳米银介导的可视化定量检测大肠杆菌的方法，特点是包括以下步骤：1）将含大肠杆菌待测溶液与大肠杆菌多克隆抗体修饰的免疫磁珠溶液混合后反应，再用磷酸盐缓冲液重复清洗3次再分散，加入大肠杆菌单克隆抗体修饰的纳米银溶液混合反应后，清洗再磁分离后得到磁珠‑细菌‑纳米银三明治结构沉淀；2）加入过氧化氢溶液反应15分钟后进行磁分离，将量子点荧光试纸条的层析纸朝下且吸水纸朝上插入银离子溶液中，反应15分钟后，在紫外灯光下，根据荧光猝灭条带长度与大肠杆菌O157:H7浓度之间的定量关系，计算获得待测溶液中大肠杆菌含量，优点是特异性好、灵敏度高、成本低且检测结果可视化。

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌的检测方法，尤其是涉及一种基于纳米银介导的可视化定量检测大肠杆菌O157:H7的方法。

背景技术

食源性疾病已成为国际上最突出的公共卫生问题之一，给民众身体健康和国民经济造成严重损害。大肠杆菌O157:H7是最重要的食源性致病菌之一，具有适应能力强、传播范围广等特点，极易引起食源性疾病，出现恶心、呕吐、出血性肠炎甚至溶血性尿毒症等症状。食物被大肠杆菌O157:H7污染后无明显性状变化，极易被忽视而引起交叉感染甚至爆发性和聚集性食物中毒，因此对食品从农田到餐桌的各环节进行大肠杆菌O157:H7快速检测和实时监控，是及时发现、预防和控制大肠杆菌感染的有效手段，对保障生命健康具有重要意义。目前，常见的大肠杆菌O157:H7检测方法有传统铺盘计数法、经典PCR和酶联免疫法（ELISA）。传统铺盘计数法较高的灵敏度和可靠性，但用时长且程序繁琐；PCR方法具有灵敏度高、时间短等优势，但易出现假阳性结果。ELISA是基于抗原-抗体反应的技术，具有特异性高的优势，但检测灵敏度不高，需要仪器和专业人员操作，不适用于现场检测。因此，开发灵敏度高、特异性好、简单快速且适用于现场检测的大肠杆菌O157:H7检测手段势在必行。

纸基分析是在纸基质上进行的检测技术，具有价格低廉、无毒环保、生物相容性好、环保轻便等优势，结合可视化检测技术，无需特殊设备和专业操作人员，肉眼即可快速检测，尤其适用于现场检测和一些条件受限的欠发达国家和地区。目前以免疫层析胶体金试纸条为主，已应用于各种食源性致病菌的快速筛查领域。但是其检测灵敏度不高，通常需要根据样品种类进行4-24小时的增菌，不利于及时发现和控制食源性疾病。而且目前的免疫层系胶体金试纸条以观察纳米金在检测线上产生的颜色深浅进行定性或半定量检测，具有操作简单、结果易读取等特点，但该方法不适用于色盲或色弱患者，且很难做到精准定量检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、成本低且检测结果可视化的基于纳米银介导的可视化定量检测大肠杆菌的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于纳米银介导的可视化定量检测大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

（1）将含大肠杆菌O157:H7的待测溶液与大肠杆菌多克隆抗体修饰的免疫磁珠溶液按体积比50:1的比例混合后，置于旋转混匀仪上反应30分钟，再用磷酸盐缓冲液重复清洗3次，再分散在待测溶液1/5体积的磷酸盐缓冲液中，再加入与大肠杆菌多克隆抗体修饰的免疫磁珠溶液等体积的大肠杆菌单克隆抗体修饰的纳米银溶液，置于旋转混匀仪上反应30分钟后，用含0.01wt%吐温-20的磷酸盐缓冲液重复清洗3次，磁分离后得到磁珠-细菌-纳米银三明治结构沉淀；

（2）将20μL 5 mM的过氧化氢溶液加入到磁珠-细菌-纳米银三明治结构沉淀中，反应15分钟后进行磁分离，得到上清为银离子溶液，将量子点荧光试纸条的层析纸朝下且吸水纸朝上插入银离子溶液中，反应15分钟后，在紫外灯光下，用荧光尺测量量子点荧光试纸条中荧光猝灭条带长度；根据荧光猝灭条带长度与大肠杆菌O157:H7浓度之间的定量关系，计算获得待测溶液中大肠杆菌O157:H7的含量。