[发明专利]一种17-羟基孕酮和雄烯二酮的检测方法

说明书

本发明涉及一种17‑羟基孕酮和雄烯二酮的检测方法。该方法包括以下步骤：待测样本溶液的制备：使用自动取样平台将待测血清标本转移至容器中，然后用自动移液平台加入内标工作液并混合，再用自动移液平台加入提取液并混合，离心，用自动移液平台转移上清液至另一容器中并浓缩，浓缩后用自动移液平台加入复溶液并混合，离心，取上清液作为样本待测溶液注入液质联用仪进行平行液相色谱测定和质谱测定。本发明方法首次实现了血清中17‑羟基孕酮及其同分异构体或者结构类似物的分离，抗干扰能力强，结果特异性高，准确度高，通过自动化移液平台进行样本制备，联合平行液相色谱质谱仪应用于样本的检测分析，可将样本制备时间缩短5倍，仪器分析通量提高1倍，并具有样本用量少、线性范围宽等优点。

技术领域

本发明涉及分析领域，特别是涉及一种17-羟基孕酮和雄烯二酮的检测方法。

背景技术

17-羟基孕酮(17-OHP)是一种内源性孕激素，由肾上腺和性腺产生，是筛查先天性肾上腺皮质增生症的特异性指标，目前主要用于新生儿先天性肾上腺皮质增生症(CAH)的一级和二级筛查，血清17-羟基孕酮是CAH的主要诊断指标，联合血清雄烯二酮还可用于先天性肾上腺皮质增生症的药物治疗效果监测，同时也用于辅助女性多毛、痤疮、不孕不育、多囊卵巢综合征等查因，儿童身材矮小、性腺发育异常等生长发育监测。

雄烯二酮(A4)是一种雄激素，主要由卵巢和肾上腺皮质分泌，生物活性介于雄性激素很弱的脱氢表雄酮和活性很强的雄性激素睾酮之间，是肾上腺皮质所分泌的中间产物，也是睾酮和雌激素的前体，它的生理作用主要是性别区分，以及促进男性青春期第二性征发育(如嗓音低沉、胡须等)，血清雄烯二酮水平增加，多见于女性多毛，月经不规则或者闭经，不孕不育等，男孩性早熟或女孩两性化，先天性肾上腺皮质增生，肾上腺皮质肿瘤，多囊卵巢综合征等，血清雄烯二酮水平降低，多见于肾上腺皮质功能减退症，卵巢功能减退症，镰状红细胞性贫血等。

目前，免疫法仍是测定人体内激素水平的主流方法，但其受不同的内源性化合物的干扰(具有相似结构的异构体等)，免疫检测法无法区分且容易产生交叉反应，导致结果的高估，同时，由于激素具有高效的特点，在人体内水平较低，免疫法无法精准地测量低水平的激素，液相色谱串联质谱法逐渐被公认为测定类固醇激素的“金标准”。液相色谱串联质谱法具备同时检测多个指标的优势，目前的方法大部分均是同时检测多个类固醇激素，但大部分的类固醇激素结构类似，化学性质差异不大，色谱出峰时间较为接近，为了实现多个类固醇指标的快速检测，势必无法做到色谱、质谱的同步分离，基本上只能实现质谱分离，而质谱无法准确区分同分异构体，因而，在快速检测多个类固醇激素的同时，部分指标容易受到同分异构体的干扰，导致结果存在偏差。

此外，目前市场上采用的血清采血管有多种类型，包含无添加剂、含促凝集、含分离胶等，品牌上也有多个厂家生产，由于液相色谱串联质谱法具有高灵敏度、高特异性，可对不同厂家采血管进行本底测定，验证对目标化合物的干扰，目前已发现，部分含促凝集、分离胶血清采血管对雄烯二酮的内标存在未知干扰物质，由于市场上规范采血管较难实现，如何实现在无需规范采血管的情况下，保证结果测定的精准性，是急需解决的难题。

同时，由于，液相色谱串联质谱法对样本要求较高，需要进行繁杂的前处理操作，进一步地净化样本，目前，前处理方法主要以手工为准，样本的前处理时间至少占据样本分析的70％以上，已成为限制液相色谱串联质谱在临床上大范围推广使用的原因之一。目前，市场上应用较多的自动化移液设备有美国Hamilton八通道自动取样平台，Bravo，Tecan等，但自动化设备仅提供一种开放式的液体处理平台，具体的程序还需要实验室根据不同检测项目的要求自行测试、优化和验证，如果移液程序没有优化好，往往很容易会出现加液的精密度低、结果重现性较差、移液体积偏差大等问题。而串联质谱进行17羟孕酮检测的分析时间一般在5-10分钟，耗时较长，限制了其在临床实验室大批量样本的检测应用，为缓解日益增长的临床检测需求和就医快速响应需求带来的人力、场地及设备投入的成本，亟需提高17-羟基孕酮和雄烯二酮项目的检测效率。