[发明专利]用于检测高危型HPV病毒的试剂盒及检测方法

说明书

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于检测高危型HPV病毒的试剂盒及检测方法。用于检测高危型HPV病毒的试剂盒是由恒温扩增区、金标制备区和胶体金试纸条组成；恒温扩增区是由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂是由解旋酶、单链DNA结合蛋白、Klenow‑I DNA聚合酶、四种dNTP混合物和buffer组成，第二试剂为HPV特异性扩增引物溶液；金标制备区包括胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液；胶体金试纸条是由被衬底板、样品垫、金标垫、基膜和吸水垫组成，被衬底板上从左到右依次设置有样品垫、金标垫、基膜和吸水垫。本发明操作便捷并有效提高了检测特异性及反应灵敏度。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于检测高危型HPV病毒的试剂盒及检测方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。在世界范围妇女中，宫颈癌(CC)及其癌前病变是列第三位的非常普遍的恶性疾病。最常见的宫颈癌发病因素为高危型HPV感染，其中HPV16、HPV18型与宫颈癌发病的关系最为密切。HPV16感染主要导致宫颈鳞癌，HPV18感染主要导致宫颈腺癌。我国宫颈癌新发病例约为6.2万例，占全球新发病例的12％，死亡病例约3万例，占全球死亡病例的11％。现已明确宫颈癌与高级别宫颈鳞状上皮内病变(HSIL，包括CINⅡ/Ⅲ级)的发生、发展主要由高危型HPV持续感染所致。在发达国家由于宫颈癌筛查制度的建立与完善，子宫颈浸润癌的发病率和死亡率已大幅度下降，但在广大发展中国家，要在短期内进行大规模、覆盖广泛、高质量的宫颈癌普查存在较大困难。我国总体人群筛查率处于低水平，2010年全国城市平均子宫颈癌筛查率为29.1％，农村仅为16.9％。HPV DNA检测多采用qPCR技术以提高HPV检出率，但其检测成本相对较高，有特殊检测设备的要求，限制了其临床应用。

核酸检测技术近年来发展迅速，尤其是在分子诊断POCT领域。其中，荧光PCR(qPCR)特异性强、灵敏度高，可以定量对病原体进行检测，但热循环过程需要热循环仪，热循环仪体积大、价格高、耗时长，使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。恒温扩增技术不需要加热循环，在恒定温度下即可使新合成的DNA模板退火变性而引发进一步扩增反应，具备价格低廉、检测快速等优势，更适合于进行基层推广和现场检测。恒温扩增技术中依赖解旋酶的恒温基因扩增(Helicase-dependent amplification,HDA)是美国NewEngland Biolabs的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制，发明的一种体外恒温基因扩增技术，与其它恒温扩增技术相比，引物设计简单，操作便捷，不需要昂贵的PCR仪，更适合在基层实验室推广应用。

先前研究证实，CRISPR/Cas系统是近年来兴起的一项靶向基因编辑工具，已广泛用于动植物、细菌、真菌、寄生虫等的靶向基因编辑。在众多类型的CRISPR/Cas系统当中，CRISPR/dCas9系统已被证实可用于核酸检测，具备灵敏高效、制备简单、成本低廉等诸多优势。但目前尚无将其应用于高危型HPV DNA检测的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测高危型HPV病毒的试剂盒，灵敏性高、特异性强且价格低廉；本发明同时提供了检测方法。

本发明所述的用于检测高危型HPV病毒的试剂盒是由恒温扩增区、金标制备区和胶体金试纸条组成；

恒温扩增区是由第一试剂和第二试剂组成，第一试剂是由解旋酶、单链DNA结合蛋白、Klenow-I DNA聚合酶、四种dNTP混合物和buffer组成，第二试剂为HPV特异性扩增引物溶液；

金标制备区包括胶体金标记的dCas9蛋白溶液和gRNA溶液；

胶体金试纸条是由被衬底板、样品垫、金标垫、基膜和吸水垫组成，被衬底板上从左到右依次设置有样品垫、金标垫、基膜和吸水垫；