[发明专利]一种人阴道粘膜模型的体外构建方法

说明书

本发明提供了一种人阴道粘膜模型的体外构建方法，采用阴道成纤维细胞和胶原构建基质层，在此基础上接种阴道上皮细胞，形成具有双层结构的体外阴道粘膜模型，在结构上与天然组织高度相似，在该模型上进行产品的阴道刺激性实验更加接近于体内真实情况，实验结果更准确可靠。阴道上皮细胞和基质层共培养时采用液下培养和气液面培养两个阶段，并且在不同的培养阶段针对细胞增殖和分化的不同需求对培养液的营养成分进行了精细化的调节，这种分段式培养法，既能保证细胞在不同发育阶段的营养需求，有利于复层化阴道粘膜上皮结构的形成，又能缩短构建时间、降低生产成本。

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种人阴道粘膜模型的体外构建方法。

背景技术

人的阴道粘膜由厚的，非角化的，分层的鳞状上皮组成，富含糖原，以及少量其他类型的细胞，例如巨噬细胞和朗格汉斯细胞。上皮细胞下面为固有层，包含许多弹性纤维和密集的血管网络，因此阴道粘膜是为局部和全身治疗输送药物的绝佳途径。但是由于长期暴露于生殖道管腔内的各种病原体中，阴道上皮也是许多病原体进入体内的潜在部位，例如在使用女性护理和美容产品，避孕药具或杀微生物剂之后，可能会造成轻度伤害，这可能会引起组织刺激，并使阴道上皮特别容易受到各种类型的感染。药品，化妆品和个人护理产品等专门配制用于人阴道粘膜的配方有时也会引起不良的局部或全身性副作用。因此，在产品投放市场之前评估新开发的化妆品、个人护理产品或局部应用药物与人阴道粘膜表面的相容性是制造商需要解决的关键问题。

分层分化的人类阴道上皮模型具有克服细胞单层膜的某些缺点的潜力，因为前者包含屏障层并允许局部施用活性成分和最终制剂，包括那些非水溶性的成分。除了可以避免动物福利风险和物种差异问题之外，体外组织模型通常还可以区分动物模型对其不敏感的非常温和的产品。

法国SkinEthic公司的RHVE模型采用外阴表皮样癌细胞系A431为种子细胞，细胞系稳定可靠，可以解决种子细胞来源困难问题，但只包含由A431细胞组成的上皮层，缺少基质层细胞和基质，因此在组织结构上还是与天然阴道组织存在较大差异。美国MatTek公司的EpiVaginaL阴道模型和中国专利CN201710048227.7中公开的人阴道上皮3D模型组织结构与天然阴道粘膜高度相似，然而由于可用的阴道组织来源有限，而且阴道黏膜上皮为复层鳞状上皮，大部分细胞属于分化成熟细胞，增殖能力较低，仅少部分基底层细胞具有较强的增殖能力，因此体外大量扩增培养条件要求较高，无法实现体外大量生产，满足市场需求。中国专利CN201710048227.7中公开的人阴道上皮3D模型还存在一些缺陷，如培养体系单一不能适应细胞不同阶段的营养需求，导致模型复层化较差，屏障功能较弱，而且该模型构建时间长，体外构建一批模型需要长达一个月时间，过长的生产周期会增加过程中的不可控因素，影响模型的稳定性，目前该模型仅限于实验室培养，未进行产业化生产，所以国内目前尚未有商业化的人阴道粘膜模型。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种人阴道粘膜模型的体外构建方法。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种人阴道粘膜模型的体外构建方法，包括如下步骤:

A、含成纤维细胞的基质层构建：

（1）取第5～10代阴道成纤维细胞，用含20%胎牛血清的DMEM配成细胞悬液；

（2）将细胞悬液和中性胶原支架按照1:9的体积比例混匀，接种到细胞培养小室中首次培养，然后在小室内外分别添加HVE-1培养液，二次培养后形成阴道粘膜模型中的基质层；

所述HVE-1培养液按照以下方法配制而成：以DMEM和F12按体积比1～3:1混合的培养基为基础液，在其中添加10％胎牛血清，添加2.0～6.0μmol/mL的谷氨酰胺，15～30μg/mL腺嘌呤，5～15μg/mL胰岛素，0.5～2.0μg/mL 氢化可的松，25～100μg/mL维生素C，1～10ng/mL成纤维细胞生长因子和5～20ng/mL转铁蛋白；

B、细胞的接种：