[发明专利]一种人阴道粘膜模型的体外构建方法

权利要求书

1.一种人阴道粘膜模型的体外构建方法，其特征在于，包括如下步骤:

A、含成纤维细胞的基质层构建：

（1）取第5～10代阴道成纤维细胞，用含20%胎牛血清的DMEM配成细胞悬液；

（2）将细胞悬液和中性胶原支架按照1:9的体积比例混匀，接种到细胞培养小室中首次培养，然后在小室内外分别添加HVE-1培养液，二次培养后形成阴道粘膜模型中的基质层；

所述HVE-1培养液按照以下方法配制而成：以DMEM和F12按体积比1～3:1混合的培养基为基础液，在其中添加10％胎牛血清，添加2.0～6.0μmol/mL的谷氨酰胺，15～30μg/mL腺嘌呤，5～15μg/mL胰岛素，0.5～2.0μg/mL 氢化可的松，25～100μg/mL维生素C，1～10ng/mL成纤维细胞生长因子和5～20ng/mL转铁蛋白；

B、细胞的接种：

吸去基质层表面的HVE-1培养液，将阴道上皮细胞或外阴表皮样癌细胞系A431细胞用HVE-2培养液配制成细胞悬液，接种到细胞培养小室中的基质层上，将培养基更换成HVE-2培养液进行浸没式培养；

所述HVE-2培养液按照以下方法配制而成：以DMEM和F12按体积比1～3:1混合的培养基为基础液，在其中添加5％胎牛血清，2.0～6.0μmol/mL的谷氨酰胺，15～30μg/mL腺嘌呤，5～15μg/mL胰岛素，0.5～2.0μg/mL 氢化可的松，1～10ng/mL成纤维细胞生长因子，5～20ng/mL转铁蛋白，0.5～2.0ng/mL 表皮生长因子，0.1～0.4nmol/mL三碘甲状腺原氨酸和5～10nmol/mL异丙肾上腺素；

C、阴道粘膜模型的培养：

吸去培养物表面的HVE-2培养液，将细胞培养小室提升至空气-液体界面进行气液面培养；将培养基更换成HVE-3培养液，培养后得到双层阴道粘膜模型；

所述HVE-3培养液按照以下方法配制而成：以DMEM和F12按体积比1～3:1混合的培养基为基础液，在其中添加5％胎牛血清，2.0～6.0μmol/mL的谷氨酰胺，15～30μg/mL腺嘌呤，5～15μg/mL胰岛素，0.5～2.0μg/mL氢化可的松，1～10ng/mL成纤维细胞生长因子，5～20ng/mL转铁蛋白，2.0～5.0ng/mL 表皮生长因子，0.1～0.4nmol/mL三碘甲状腺原氨酸，5～10nmol/mL异丙肾上腺素，25～100μg/mL维生素C和1.0～1.5μmol/mL CaCl₂。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤A中阴道成纤维细胞的分离和培养步骤如下：

（1）将分离的阴道组织固有层放入胶原酶消化液中消化，然后使用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，过滤后离心去上清，收集阴道成纤维细胞；

（2）PBS清洗阴道成纤维细胞，重悬细胞沉淀于含10%新生牛血清的DMEM培养液中，传代培养至第五代后用于进行阴道粘膜模型中基质层的构建。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤B中阴道上皮细胞的分离和培养步骤如下：

（1）将人体阴道组织置于培养皿中， PBS溶液清洗6次，除去粘膜下组织，将组织块切块加入分散酶中消化；

（2）眼科镊分离出阴道粘膜上皮层和固有层，将阴道粘膜上皮层放入胰酶-EDTA中消化；

（3）使用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，过滤后离心去上清，收集阴道粘膜上皮细胞；

（4）PBS清洗阴道粘膜上皮细胞，重悬细胞沉淀于无血清上皮细胞培养液中，获得分离成单个细胞的阴道上皮细胞悬液，传代培养至第二代得到纯度达95%以上的阴道上皮细胞。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤B中外阴表皮样癌细胞系A431细胞的培养过程为：重悬外阴表皮样癌细胞系A431细胞沉淀于含10％胎牛血清、2.0～6.0μmol/mL谷氨酰胺、0.1～1μmol/mL丙酮酸钠和4.5g/L高糖的DMEM培养液，传代培养至第七代后用于进行上皮层的构建。