[发明专利]一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法

说明书

本发明公开了一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法，包括如下步骤：(1)向赖氨酸营养缺陷型菌株中导入含赖氨酸脱羧酶基因的质粒，得到重组工程菌；(2)将步骤(1)所得重组工程菌于含赖氨酸的培养基中培养，通过测定ODsubgt;600/subgt;筛选表达赖氨酸脱羧酶的重组工程菌。本发明偶联了赖氨酸营养缺陷型菌株的生长状态与赖氨酸脱羧酶的酶活，无需检测底物及产物消耗，更加快速且高效，即实现了大肠杆菌生长状态与赖氨酸脱羧酶酶活偶联，对赖氨酸脱羧酶的定向进化具有深远意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法。

背景技术

赖氨酸脱羧酶是一种专一对L-赖氨酸进行脱羧反应的生物酶，其催化特点：专一性高，在合适反应条件下具备非常高的酶活；但是存在反应pH范围窄、温度稳定性差等特点。因此，开发一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法对赖氨酸脱羧酶的定向进化具有现实意义。

CRISPR-Cas系统是一种细菌的免疫防御系统，由细菌在长期抵御外源DNA的过程中进化而形成，能够降解入侵的外源DNA(病毒或噬菌体等)，广泛存在于细菌和古细菌中。II型CRISPR-Cas9系统在目前基因编辑方面应用最为广泛。该系统主要由三部分组成：起靶向目的序列的crRNA、能够和crRNA配对连接的tracrRNA以及酶切目的序列的Cas9蛋白。CRISPR序列转录成熟的crRNA与tracrRNA通过碱基互补配对，形成部分具有双链的RNA结构，进而和Cas9蛋白形成复合体，剪切外源DNA。研究者将crRNA和tracrRNA整合在同一条单链中，设计出了长度为20bp左右的单链引导RNA(single guide RNA，sgRNA)，sgRNA有两个功能，即可以与目的DNA序列互补配对，同时引导Cas9蛋白，实现基因的敲除等功能。近年来，CRISPR-Cas9技术已经广泛应用于微生物的基因组编辑和功能研究，尤其在细菌的基因编辑方面，取得了很大的进展。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种高通量筛选赖氨酸脱羧酶的方法，包括如下步骤：

(1)向赖氨酸营养缺陷型菌株MG1655ΔlysA中导入含赖氨酸脱羧酶cadA基因的质粒ptrc-cadA，得到重组工程菌MG1655ΔlysA/ptrc-cadA(简称MGAA)；

(2)将步骤(1)所得重组工程菌于含赖氨酸的培养基中培养，通过测定OD₆₀₀筛选表达赖氨酸脱羧酶的重组工程菌。

步骤(1)中，所述赖氨酸营养缺陷型菌株在无外源添加赖氨酸的培养基中不能正常生长。

步骤(1)中，所述赖氨酸营养缺陷型菌株的构建方法为将大肠杆菌工程菌株MG1655中的lysA基因敲除；优选地，利用CRISPR-Cas9编辑技术敲除大肠杆菌工程菌株MG1655中的lysA基因。

步骤(1)中，所述赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

步骤(1)中，含赖氨酸脱羧酶基因的质粒ptrc-cadA的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

其中，所述含赖氨酸脱羧酶基因的质粒ptrc-cadA的构建方法为将PCR复制大肠杆菌工程菌株MG1655中的赖氨酸脱羧酶cadA与载体质粒ptrc(pTRC99a(ΔlacO))酶切后连接。

其中，PCR复制的引物中，上游引物带有Nco I酶切位点，下游引物带有BamH I酶切位点。

其中，所述载体质粒ptrc的构建方法为将pTRC99a的lacO部分碱基移除，所述载体质粒ptrc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。