[发明专利]一种免疫磁性表面增强拉曼基底检测丝素蛋白的方法

权利要求书

1.一种免疫磁性表面增强拉曼基底检测丝素蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）称取5-6g FeCl₃·6H₂O和2-4gFeSO₄·7H₂O溶解在蒸馏水中，将溶液倒入容器中，在充氮气的条件下搅拌至溶解；加入3-5gNaOH，70-90℃水浴持续搅拌0.5-1.5h制得Fe₃O₄磁性纳米颗粒；

2）称取200 mg Fe₃O₄于容器中，加入15-20mL浓硝酸，超声10-30 min，随后水洗，加入15-25 mL无水乙醇，35-45mL去离子水及 3-5 mL氨水超声10-30min后取出，搅拌下缓慢滴加3-4mL TEOS，持续搅拌3-5h，随后乙醇洗，水洗，转移到比色皿中， 55-65℃条件下真空干燥1-3h得到Fe₃O₄@SiO₂纳米颗粒；

3）取150-200 mL去离子水于容器中，加入8-12 mL 1.5-2.5%HAuCl₄，在400-800 r/min，120-140℃条件下搅拌20-30 min，随后加入8-12 mL、40-60mg/mL柠檬酸钠水溶液，在120-140℃条件下继续搅拌 20min，然后停止加热，继续搅拌至Au 溶胶为室温；

4）量取30-50 mg Fe₃O₄@SiO₂于容器内，倒入50-100mL无水乙醇超声清洗 1-10min，重复，再水洗，随后加入30-50 mL 2-4%的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，35-45℃摇晃溶液至溶解，搅拌 15-25 min，水洗4-8次，得到聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的 Fe₃O₄@SiO₂；

5）超声条件下向150-250 mL步骤3）所得 Au 溶胶中迅速加入聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的 Fe₃O₄@SiO₂，摇晃条件下将含溶液的容器放入摇床内，常温摇晃 20-30min，水洗，得到Fe₃O₄@SiO₂-Au；

6）称量 0.8-1.2gFe₃O₄@SiO₂-Au放入含有 80-120mL无水乙醇的容器中，超声分散，待固体完全分散后加热至60-80℃，缓慢内滴加25-35ml 的APTEs，在N₂条件下回流4-8h；反应结束后离心得到固体，用无水乙醇洗涤后真空干燥得（H₂N-）Fe₃O₄@SiO₂-Au；

7）取450-550mg（H₂N-）Fe₃O₄@SiO₂-Au，加入到100mL PBS缓冲液中，超声分散；加入180-220mL、20-30%的戊二醛溶液，在30-40℃的振荡水浴锅中振荡反应2-3小时；磁性分离固液相，用PBS清洗3-5遍，之后将活化所得磁珠分散在40-60mL PBS缓冲液中，得到8-12mg/mL的活化的（H2N-）Fe₃O₄@SiO₂-Au；

8）取25-35mL上述的活化的（H₂N-）Fe₃O₄@SiO₂-Au，向其中加入含有20-55mg丝素蛋白单克隆抗体的BSA溶液，在30-40℃下振荡反应1-3h；

9）取丝素蛋白溶解在CB溶液中，加入步骤8）中结合抗体的（H₂N-）Fe₃O₄@SiO₂-Au，在30-40℃条件下震荡孵育1-3h；

10）混合均匀后滴在硅片上测试拉曼。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中，2价Fe与3价Fe的摩尔比为1：1.5-2，反应溶液为100mL。