[发明专利]用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法与应用

说明书

本发明属于免疫学和生物技术领域，为了解决目前针对胰蛋白酶类似物TrypLE没有较好的检测方法，提供了胰蛋白酶类似物TrypLE双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法与应用。通过构建一种酶联免疫吸附的方法，可以有效，快速，便捷的检测样品中TrypLE的含量。包括：包被有捕获抗体的酶标板制成的固相抗体、酶标抗体、TrypLE标准品、样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中胰蛋白酶的专用试剂盒。本试剂盒操作方便简单，可直接用于样品分析，重现性好，稳定性高。

技术领域

本发明属于免疫学和生物技术领域，具体涉及用于检测胰蛋白酶类似物的TrypLE双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法与应用。

背景技术

胰蛋白酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋白酶的一种，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是胰蛋白酶的前体胰蛋白酶原被合成后，作为胰液的成分而分泌，受肠激酶或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。

TrypLE是一种胰蛋白酶类似物，是一种通过生物工程制备的非动物源性重组酶，目前主要应用于细胞培养中。在细胞培养中，它可以替代猪和牛的胰蛋白酶来进行对贴壁细胞的解离。TrypLE因其制备方式，一般具有较高纯度，这也导致了其比天然胰蛋白酶配制剂有更强的特异性。此外，TrypLE 作用细胞时更加温和，并且终止消化时不需要 Trypsin酶抑制剂，只需要使用稀释液进行稀释即可停止反应，这样极大程度上减少了外来物质对培养细胞的干扰。TrypLE已经被证明有能力去解离来自有无血清供应培养基的细胞。

胰蛋白酶及其类似物为肽链内切酶，对精氨酸和赖氨酸肽链具有选择性水解作用，可使天然蛋白、变性蛋白、纤维蛋白和黏蛋白等水解为多肽或氨基酸。主要应用是在细胞培养时，使细胞间的蛋白质水解，从而使细胞离散或使贴壁细胞解离下来。

Trypsin作为通过动物体提取的酶类，其不可避免的存在批间差异大与纯度较低的问题，而TrypLE作为通过生物反应器的非动物源产物，其纯度高，批间差异小，这也意味着其特异性更加显著。着通过比较trypsin和TrypLE这两种酶，我们可以发现TrypLE在诸多方面存在着更加优越的性能。Trypsin 必须保存在－20 ℃，在经过多次反复冻融或在 4℃长期保存后，稳定性丧失，TrypLE 则可以稳定的保存于室温，节省了冷冻空间，同时提供即时可用的便利。有研究显示，与胰蛋白酶相比，TrypLE将人胚胎干细胞克隆存活和生长状况提高了3倍，这使得其在细胞培养中可以更有利于细胞的生、传代。通过以上比较，可以看出TrypLE是一种极具潜力的胰蛋白酶代替物。

胰蛋白酶现行标准收载于《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版第二部，收录的检测项目未包含残留量检测，滞后于目前药品生产与质量控制中的要求。这不仅在细胞培养过程中带来潜在的风险，会给相关生物制品的临床使用造成安全隐患，也是生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制中仍需完善的一环。而TrypLE作为目前较为常用的胰蛋白酶类似物，其残留检测的重要性也愈发显著。

但是，目前针对这种代替物没有好的检测方法，因此，有必要选用一种快速、简便能够定量且灵敏度、准确度和特异性高的方法来进行TrypLE的检测。

发明内容

本发明为了解决目前针对胰蛋白酶类似物TrypLE没有较好的检测方法，提供了用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法与应用。通过构建一种酶联免疫吸附的方法，可以有效，快速，便捷的检测样品中TrypLE的含量。