[发明专利]用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法与应用

权利要求书

1.一种用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有捕获抗体的酶标板制成的固相抗体、酶标抗体、TrypLE标准品、样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液；所述捕获抗体为采用TrypLE抗原免疫小鼠，经融合、克隆、筛选得到的单克隆抗体，捕获抗体用0.5-5ug/ml包板；所述酶标抗体为HRP-兔多克隆抗体；所述兔多克隆抗体的大小为25kd，其纯度为99%；

所述单克隆抗体的制备方法为：TrypLE抗原40μg与弗氏完全佐剂混合免疫小鼠，2周后以相同剂量的TrypLE抗原第二次免疫小鼠，细胞融合前3d，以相同剂量无佐剂 TrypLE抗原加强免疫；然后取无菌免疫小鼠的脾细胞，与SP2/0细胞在 PEG4000 作用下融合，采用间接ELISA 法筛选阳性杂交瘤细胞株，获得腹水单克隆抗体；

所述HRP-兔多克隆抗体的制备方法为：TrypLE抗原免疫兔子，第一次免疫时将200ug的弗 氏完全佐剂与200ug抗原充分混匀免疫兔子；第二次免疫为第14天相同剂量抗原免疫兔子，第三次免疫为第35天相同剂量抗原免疫兔子，采用抗原亲和树脂层析法纯化多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述捕获抗体为抗TrypLE抗原的鼠单克隆抗体；捕获抗体用2ug/ml包板。

3.根据权利要求1所述的用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为 pH=7.4的1×PBST，含PBST 体积0.05%的Tween-20；包被缓冲液为 pH=9.6的0.05M碳酸盐缓冲液；封闭液为 pH=7.4的1×PBST，含PBST 体积3%的BSA；ELISA酶标板洗涤液为 pH=7.4的1×PBST，含0.05%Tween-20；显色液为显色液A和显色液B等体积混合，显色液A为H₂O₂，显色液B为TMB；终止液为2mol/L浓H₂SO₄。

4.根据权利要求1所述的用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述TrypLE标准品为标准品A-F：将TrypLE标准品使用稀释液稀释至40ng/mL、16ng/mL、6.4ng/mL、2.56ng/mL、1.024ng/mL、0.410ng/mL。

5.权利要求1所述用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：具体方法为：

（1）制备ELISA酶标板：包被缓冲液将抗TrypLE抗原的单克隆抗体稀释成0.5-5ug/ml，混匀后按100μl/孔加入空的酶标板，用封板膜封板；4℃包被过夜；PBST洗涤后，封闭液封闭37℃温育120min；封闭结束后PBST洗涤；

（2）ELISA试剂盒各组分的配制：配置试剂盒内ELISA酶标板、标准品、酶标抗体、样品稀释液、ELISA酶标板洗涤液、显色液A、显色液B、终止液、封板膜；

其中：标准品为标准品A-F：将TrypLE标准品使用稀释液稀释至40ng/mL、16ng/mL、6.4ng/mL、2.56ng/mL、1.024ng/mL、0.410ng/mL；酶标抗体：以1:5000-1:20000稀释的HRP-兔多克隆抗体；样品稀释液：pH=7.4的1×PBST，含0.05%Tween-20；20×ELISA酶标板洗涤液：pH=7.4的1×PBST，含0.05%Tween-20；显色液A为H₂O₂，显色液B为TMB；终止液：2mol/L浓H₂SO₄。

6.根据权利要求5所述用于检测胰蛋白酶类似物TrypLE的双抗夹心ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述TrypLE标准品的原液浓度为20μg/mL；包被缓冲液将抗TrypLE抗原的单克隆抗体稀释成2ug/ml；所述酶标抗体为HRP-兔多克隆抗体以按1：15000稀释。