[发明专利]一种基于咖啡环的细胞快速分类与定量方法

说明书

本发明公开了一种基于咖啡环的细胞快速分类与定量方法，属于细胞检测领域。本发明关键在于提供了一种细胞悬液咖啡环的LIBS信号采集方法，该方法主要通过是将细胞悬液滴加于单晶硅片，自然干燥，形成咖啡环后，对咖啡环区域内细胞内源性特征元素的进行LIBS信号采集。本发明还提供了一种构建细胞特征性环形印记指纹元素图谱库的方法，以及对应的细胞特征性环形印记指纹元素图谱库。本发明还提供了一种细胞分类方法，它利用样本环形印记指纹元素图谱与前述图谱库的比对，实现细胞分类。本发明还基于细胞悬液咖啡环的LIBS信号采集方法提供了一种细胞定量方法，该方法基于LIBS信号中谱线强度值与细胞浓度间的线性关系，实现定量。

技术领域

本发明属于细胞检测领域。

背景技术

细胞的分类和定量，在现代医学检测中应用十分普遍。

细胞分类方法主要包括染色镜检法、流式细胞术、VCS联合检测技术等。其中染色镜检法是利用细胞对酸碱性染料的亲和力或细胞内过氧化物酶活性来对用特定染料进行染色后，在显微镜下区分的方法，该方法仅对某些特定细胞(例如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞)有用，无法对绝大多数细胞进行分类。流式细胞术需对细胞进行荧光抗体的标识，通过流式细胞仪检测带特定荧光的细胞，其无法检测痕量样本，试剂成本较高。VCS联合检测技术是联合使用电阻抗检测细胞体积，电导射频法检测细胞内核，激光散射法检测细胞颗粒特性，其使用较为繁琐。

细胞定量方法主要包括血球计数板计数、电阻抗法、流式细胞术等。血球计数板需要人工计数，效率低下，而电阻抗法和流式细胞术需要的样本量较大，在面临微量样品检测时有一定的难度。

激光诱导击穿光谱(laser-induced breakdown spectroscopy，LIBS)技术是一种用于分析物质所含元素及其含量的光谱学技术，当一束高能脉冲激光聚焦到检测对象上时，会在极短时间内产生高温、高密度的等离子体，冷却时于激发态的原子跃迁会基态发出特定元素的原子谱线，用光谱仪直接收集样品表面等离子体产生的发射谱线信号，在计算机上记录得到特征光谱，可根据发射光谱的强度进行分析。LIBS技术以其快速、痕量、几乎不受样本相态以及元素种类限制等独特优势在多领域都有着广泛的应用。

目前未见将LIBS技术用于细胞分类的应用，但LIBS可用于微量样品中的细胞定量。不过，LIBS技术在进行细胞定量时容易受到咖啡环效应的影响。

咖啡环效应，是指当一滴咖啡(或其他有色液体)滴到平面上后，经过干燥形成印记，印记颜色是不均匀的，边缘部分要比中间更深一些，形成环状斑的现象；所形成的环状斑，即为咖啡环。咖啡环效应的原因是由于液滴边缘的蒸发速率超过中心的蒸发的速率，使液滴中的粒子由中心向周围边缘扩散，颗粒物沉积在固液接触面的边沿。

为了克服咖啡环效应的影响，CN 110927143 A公开了将LIBS检测的样品富集到环形槽中，可以大大降低咖啡环效应造成的富集不均匀问题，但这样的样品载体成本较高。有的检测在采样时避开咖啡环区域，只选择中间相对均匀但细胞数量稀少的区域，但这样做的信噪比很低。

发明内容

本发明要解决的问题是：克服技术偏见，不规避咖啡环，反而利用咖啡环进行LIBS信号采集，进而构建细胞特征性环形印记指纹元素图谱库，得出基于咖啡环的细胞分类与定量方法。

本发明解决技术问题的技术方案具体如下：

一种细胞悬液咖啡环的LIBS信号采集方法，包括如下步骤：

1)用缓冲液洗涤待检细胞2次以上后重悬，得细胞悬液；

2)将细胞悬液滴加于单晶硅片，自然干燥，形成咖啡环；

3)对咖啡环区域内细胞内源性特征元素的进行LIBS信号采集。

进一步地，步骤2)所述单晶硅片经如下方法处理：