[发明专利]基于Alpha技术高通量、多靶标筛查化学品核受体活性的方法

权利要求书

1.一种基于Alpha技术高通量、多靶标筛查化学品核受体活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备GST-重组人核受体的配体结合域GST-hNR-LBD蛋白，步骤包括：

用Trizol试剂提取人乳腺癌细胞MCF-7的总RNA，反转成cDNA并作为模板；

参考NCBI公布的人核受体的配体结合域hNR-LBD的编码序列，设计引物扩增得到hNR-LBD DNA片段；

根据hNR-LBD DNA片段，利用大肠杆菌克隆得到GST-hNR-LBD蛋白；

(2)制备生物素-核受体转录辅助激活因子的核受体相互作用结构域Biotin-SRC-RID多肽，步骤包括：

利用多肽固相合成法合成核受体转录辅助激活因子的核受体相互作用结构域SRC-RID多肽；

合成结束后对SRC-RID多肽进行裂解，利用冷乙醚离心沉淀法进行沉淀，利用HPLC进行纯化，再利用生物素标记试剂盒进行标记，获得Biotin-SRC-RID多肽；

(3)利用Alpha方法快速测定不同浓度化学品的hNR受体活性，步骤包括：

将GST-hNR-LBD蛋白与Anti-GST Alpha受体微珠用分析缓冲液混匀，预孵育使GST-hNR-LBD蛋白标记在受体微珠上；

将Biotin-SRC-RID多肽与链霉亲和素标记的供体微珠用分析缓冲液混匀，预孵育使Biotin-SRC-RID多肽标记在供体微珠上；

将预孵育的GST-hNR-LBD蛋白与受体微珠混合物加入到孔板孔中，然后加入等体积的分析缓冲液和待测化学品，震荡孔板使各组分混匀，室温黑暗进行第一次孵育；

将预孵育的Biotin-SRC-RID多肽与链霉亲和素标记的供体微珠混合物加入到孔板孔中，震荡孔板使各组分混匀，室温黑暗进行第二次孵育；

使用安装有AlphaLisa或AlphaScreen卡盒的多功能酶标仪读取孔板信号，根据所得读数绘制每种测试化学品的S形剂量效应曲线，得到半最大效应浓度EC50，根据EC50判断物质的受体结合活性强弱。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，人核受体包括人雌激素受体hERα和hERβ，甲状腺激素受体hTRα和hTRβ，维生素D受体hVDRα，维甲酸受体hRAR，雌激素相关受体hERRγ中的至少一种。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中根据hNR-LBD DNA片段，利用大肠杆菌克隆得到GST-hNR-LBD蛋白的步骤包括：

利用双酶切方法，将hNR-LBD DNA片段连接到大肠杆菌带GST标签的表达载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆测序，获得原核重组表达载体；

提取重组质粒，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，获得hNR-LBD重组表达菌；

将hNR-LBD重组表达菌进行放大培养，加入IPTG，诱导hNR-LBD重组蛋白表达；

通过超声破碎、亲和层析，对hNR-LBD重组蛋白进行纯化，得到GST-hNR-LBD蛋白。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，SRC-RID多肽为含有LXXLL结构域、长度为10-60个氨基酸的多肽的一种或多种混合物，其中L表示亮氨酸，X表示任意氨基酸。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中GST-hNR-LBD蛋白与Biotin-SRC-RID多肽的摩尔比为1:1-1:10，GST-hNR-LBD蛋白与Anti-GST Alpha受体微珠的体积比为2:1-10:1，Biotin-SRC-RID多肽与链霉亲和素标记的供体微珠的体积比为2:1-10:1。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中GST-hNR-LBD蛋白与Biotin-SRC-RID多肽的摩尔比优选为1:5，GST-hNR-LBD蛋白与Anti-GST Alpha受体微珠的体积比优选为3:1，Biotin-SRC-RID多肽与链霉亲和素标记的供体微珠的体积比优选为5:1。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中孔板选用384孔板。