[发明专利]一种甾体固醇类物质来源性检测方法及其应用

说明书

本发明属于提取及其分析化学技术领域，更具体的，本发明涉及一种甾体固醇类物质来源性检测方法及其应用，所述甾体固醇类物质来源性检测方法，包括：提取样品中甾体固醇类物质后进行GC‑C‑IRMS检测分析δ¹³C值。本发明开发的GC‑C‑IRMS检测方法的检测浓度线性范围为10～13000ng/mL，在取用3mL尿样时，对尿样中含量较低的T、5α‑diol的最低检测浓度为10ng/mL，对尿样中浓度较高的An和Etio的最低检测浓度为100ng/mL。本发明所述检测过程只需一次液相分离，无需衍生化；质谱检测过程仪器线性良好，对各分析物进行单独的线性模型试验测试，得到的不确定度结果符合最新WADA2021检测标准，分析时间短，效率高，符合大型赛事兴奋剂检测要求。

技术领域

本发明属于提取及其分析化学技术领域，更具体的，本发明涉及一种甾体固醇类物质来源性检测方法及其应用。

背景技术

内源性甾体固醇类物质可以通过调节体内代谢水平，因此基于此的合成类固醇药物被国际奥委会列为违禁药物。同时，由于此类物质在人体尿液中存在形式复杂多变，不易检测，如睾酮，由于体内自身合成的睾酮和睾酮制剂中的睾酮的分子结构完全一致，常规的液相/气相质谱仪不能区分体内自身合成的睾酮和外源摄入的睾酮。同时，由于个体差异、不同的生理状况，尿样中的睾酮浓度变化范围较大，因此，尿样中外源性的睾酮及其代谢物的确证，一直以来都是兴奋剂检测领域的重点和难点。建立同位素比质谱法检测尿中类固醇来源的方法，已成为兴奋剂检测的重中之重，用来确定是否使用内源性类固醇兴奋剂具有重要意义。

目前，用同位素比质谱方法检测内源性类固醇的研究所经历的时间并不长，1990年首次报告人体自身分泌的睾酮与合成制剂的睾酮的δ¹³C值是有差异的，证明该分析方法在兴奋剂检测中具有很大的应用价值。大多数人工合成的类固醇激素均来自于植物基质，相对于人体自身合成的类固醇激素，人工合成的类固醇激素具有更贫乏的δ¹³C值。当人体摄入外源性激素后，其体内的内源性物质及其代谢物的δ¹³C值将随之变化，而与外源性激素代谢无关的其他类固醇激素则不受影响。同时，各国对样品前处理的方法差别较大，各有特色，目前国际常用的方法是使用两次液相分离纯化，提高分析物的纯度，或通过化学衍生化手段，使分析物在气相色谱上完全分离。但是共同要解决的问题是：操作繁琐，费时，灵敏度低，样品用量大等，本发明开发的方法相对快速，重现性好，样品用量少，满足样品分析要求。

发明内容

针对现有技术中存在的一些问题，本发明第一个方面提供了一种甾体固醇类物质来源性检测方法，包括：提取样品中甾体固醇类物质后进行GC-C-IRMS检测分析δ¹³C值。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述GC-C-IRMS检测分析过程包括：甾体固醇类物质分别进行气相色谱分析、升温燃烧程序以及同位素比质谱分析，其中气相色谱分析中色谱柱的升温程序包括：升温至150℃，保温1-5min；以30℃/min升温至200℃；接着以2.5℃/min升温至200-290℃，保温1-3min；然后以30℃/min升温至290-350℃，保温1-3min。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述气相色谱分析中色谱柱的柱长为15-60m，内径为0.25-0.32mm，液膜厚度为0.15-0.25μm。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述提取样品中甾体固醇类物质过程包括：样品在缓冲液以及酶的作用下，于50-60℃酶解1-3h后，冷却，加入碱液以及萃取剂，震荡离心，取上清液，于65-75℃下N₂吹干后加入高效液相色谱洗脱液进行HPLC分离纯化；之后在65-80℃N₂吹干后，使用IRMS上机溶液进行溶解，即得。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述缓冲液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液，所述磷酸盐缓冲液的pH为6-6.9。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述碱液的浓度为15-25wt％。