[发明专利]一种椎间盘单细胞的分离方法

说明书

本发明公开提供了一种椎间盘单细胞分离方法，包括：获得活体椎间盘组织样本，于生物洁净工作台去除混杂组织及血液，分离终板、纤维环和髓核，得到单一组织样本；将单一组织样本依次以胰蛋白酶、链霉蛋白酶、Ⅱ型胶原酶消化，得组织悬液；将组织悬液经过滤得细胞悬液，再离心弃上清后以红细胞裂解液重悬处理，然后再通过磁珠分选法或流式细胞分选法分选，即得单细胞样本。本发明提供的椎间盘单细胞分离方法首次采用高特异性酶消化及细胞分选策略，充分消化细胞外基质,高效去除消化残留杂质及细胞双倍体,在未经过体外扩增培养的条件下,获得代表椎间盘细胞体内真实表达及分布的、高纯度、高活力、满足单细胞测序建库标准的椎间盘单细胞原代(P0)代细胞。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种椎间盘单细胞的分离方法。

背景技术：

椎间盘是两个相邻椎骨的椎体之间的软骨连接，由上下软骨终板、外围的纤维环和中心的髓核组成。腰腿痛是临床上高发的疾患之一。研究报道大多数患者腰腿痛均是由于椎间盘退变引起的，40岁以上人群中发病率高达40％-70％，其相关诊疗费用对社会造成巨大的经济负担。目前的椎间盘退行性变的治疗策略，主要包括物理治疗、药物治疗、介入治疗、手术治疗等传统手段，仅可对症治疗，而无法改善椎间盘退变的病理进程，导致无法根除椎间盘退变的发生。最新研究发现，生物治疗策略是椎间盘退行性疾病具有前景的治疗手段，其中基于细胞治疗和组织工程的细胞移植技术目前最受关注，其治疗的重点是修复或替换退变的椎间盘组织，以重建椎间盘功能。然而，目前椎间盘生物治疗的进展，关键在于对椎间盘的生理与病理微环境认识缺乏了解，尤其是对椎间盘内的细胞异质性尚缺乏深入研究。

单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术是近年来得到快速发展的高通量测序技术，被认为是解决细胞异质性和解析复杂细胞生态位细胞成分的强大工具。单细胞RNA测序对细胞样本质量的要求极为严格，需具有高活性(≥80％)和高纯度(去除组织碎片和细胞粘连体等)等特殊要求，以确保单个细胞测序信息的准确性和可靠性。而传统技术分离椎间盘原代细胞的方法，由于酶的特异性较差，消化时间长，消化不彻底，导致细胞活力低下，产生的组织碎片和细胞粘连体较多，无法满足单细胞RNA测序的要求。亦有方法通过体外培养后获得P1代细胞，以提高细胞的活率和浓度,但是体外培养后细胞表型常常会产生较大改变,且丢失了不会贴壁、增殖活性较低的细胞亚群，无法代表椎间盘细胞在体内真实表达及分布情况,因此也不适用于单细胞测序。

因此亟需研发一种适用于单细胞RNA测序样本需求的高活性与高纯度椎间盘原代(P0)代细胞的分离方法，所分离的椎间盘细胞可反映体内的真实表达及分布情况，为后续椎间盘的细胞异质性研究提供优质的细胞标本。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种椎间盘单细胞样品的分离方法，包括：

1)获得活体椎间盘组织样本，于生物洁净工作台以含青链霉素的PBS洗净组织至无肉眼可见血液沾染，然后，分离终板、纤维环和髓核，并分别保存，得到单一组织样本；

2)将单一组织样本分别充分剪碎，以含青链霉素的PBS重悬，离心，弃上清，得第一沉淀；

3)将所述第一沉淀与0.25％胰蛋白酶溶液混合，于37℃消化30分钟，消化后离心，弃上清，得第二沉淀；

4)将所述第二沉淀与0.2％链酶蛋白酶溶液混合，于37℃消化60分钟，消化后离心，弃上清，得第三沉淀；

5)将所述第三沉淀与Ⅱ型胶原酶溶液混合，于37℃消化至组织消化完全，得组织悬液；

6)将所述组织悬液经40μm细胞滤网过滤，得到细胞悬液，再将所述细胞悬液离心，弃上清，得第四沉淀；

7)将所述第四沉淀以红细胞裂解液重悬细胞，室温下静置5分钟，然后再加入2mL含青链霉素的PBS，离心，弃上清，得第五沉淀；

8)将所述第五沉淀通过磁珠分选法或流式细胞分选仪法获取细胞，即得单细胞样本。