[发明专利]一种椎间盘单细胞的分离方法

权利要求书

1.一种椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，包括：

1)获得活体椎间盘组织样本，于生物洁净工作台以含青链霉素的PBS洗净组织至无肉眼可见血液沾染，然后，分离终板、纤维环和髓核，并分别保存，得到单一组织样本；

2)将单一组织样本分别充分剪碎，以含青链霉素的PBS重悬，离心，弃上清，得第一沉淀；

3)将所述第一沉淀与0.25％胰蛋白酶溶液混合，于37℃消化30分钟，消化后离心，弃上清，得第二沉淀；

4)将所述第二沉淀与0.2％链酶蛋白酶溶液混合，于37℃消化60分钟，消化后离心，弃上清，得第三沉淀；

5)将所述第三沉淀与Ⅱ型胶原酶溶液混合，于37℃消化至组织消化完全，得组织悬液；

6)将所述组织悬液经40μm细胞滤网过滤，得到细胞悬液，再将所述细胞悬液离心，弃上清，得第四沉淀；

7)将所述第四沉淀以红细胞裂解液重悬细胞，室温下静置5分钟，然后再加入2mL含青链霉素的PBS，离心，弃上清，得第五沉淀；

8)将所述第五沉淀通过磁珠分选法或流式细胞分选仪法获取细胞，即得单细胞样本。

2.如权利要求1所述的椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，所述含青链霉素的PBS为含2％青链霉素的无Ca²⁺Mg²⁺PBS。

3.如权利要求1所述的椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，步骤5)中若单一组织样本为髓核组织时，Ⅱ型胶原酶溶液的浓度为0.1％；若单一组织样本为终板或纤维环时，Ⅱ型胶原酶溶液的浓度为0.2％。

4.如权利要求1所述的人类椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，步骤2)、3)、4)、5)、6)和7)中的离心条件为4℃、300g离心5min。

5.如权利要求1所述的椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，步骤2)中所述充分剪碎是通过圆剪和眼科剪将所述单一组织样本剪碎至1mm³大小。

6.如权利要求1所述的椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，

步骤3)中，以g:ml计第一沉淀与胰蛋白酶溶液的比例为1：5；

步骤4)中，以g:ml计第二沉淀与链酶蛋白酶溶液的比例为1：5；

步骤5)中，以g:ml计第三沉淀与Ⅱ型胶原酶溶液的比例为1：5。

7.如权利要求1所述的椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，

步骤8)在分选前还包括，吸取适量所述重悬细胞悬液以AO/PI溶液染色计数；

优选地，所述重悬细胞悬液与AO/PI溶液以1:1体积比混匀后立即计数；优选地，所述计数是利用Counter Star计数仪实现的。

8.如权利要求1所述的人类椎间盘单细胞样品的分离方法，其特征在于，所述磁珠分选法包括：

a)以适量Dead Cell Removal Micro Beads重悬细胞，轻柔混匀后室温孵育15分钟；

b)将MACS Separator分离器吸附于MACS MultiStand支架，并将MS柱吸附于分离器上，并以1×Binding Buffer进行润洗；

c)向孵育好的细胞中加入适量1×Binding Buffer，轻柔混匀，转移至MS柱悬空滴加，活细胞靠重力过柱；

d)待MS柱中液体即将滴完时再悬空加入1×Binding Buffer冲洗数次，离心，弃上清，用适当体积的PBS+0.04％BSA重悬细胞。