[发明专利]一种从瓮棺土样中提取羊毛角蛋白进行蛋白质组学检测的方法

权利要求书

1.一种从瓮棺土样中提取羊毛角蛋白进行蛋白质组学检测的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取500mg氨基化的磁性纳米颗粒，加入到40-60mL PBS缓冲液中，超声分散；加入150-250mL、20-30wt%戊二醛溶液，在30-40℃的振荡水浴锅中振荡反应2-3小时；

2）磁性分离固液相，用PBS缓冲液清洗3-5遍，之后将活化后的磁性纳米颗粒分散在40-60mL PBS缓冲液中，得到5-15mg/mL的磁性纳米粒子溶液；

3）取30mL上述磁性纳米粒子溶液，向其中加入含有20-55mg兔抗角蛋白单克隆抗体的BSA溶液，在30-40℃下振荡反应1-3h；

4）取100mg混有羊毛角蛋白的瓮棺土样溶解在碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，在50-80℃的震荡水浴锅中溶解2-3h后冷却；

5）用PBS缓冲液洗涤步骤3）中所得的免疫磁珠，加入步骤4）中所得的瓮棺土样提取液，在30-40℃条件下震荡孵育1-3h；

6）磁性分离，PBS缓冲液洗涤，除去杂质和上清液，得到羊毛角蛋白结合的免疫磁珠；

7）对羊毛角蛋白结合的免疫磁珠进行蛋白质组学分析，得到蛋白序列数据。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）、2）、5）、6）中PBS缓冲液的pH=7.4。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中，所述戊二醛溶液的溶剂为pH=7.4的PBS。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中，兔抗羊毛角蛋白抗体为全序列抗体，BSA溶液中BSA的浓度为8-12mg/mL；抗体稀释倍数为1:1000-1500。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）中，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的pH=9.6。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5）中，震荡过程中定时进行上下颠倒，使瓮棺土样提取液成均匀悬浊液。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤6）中，磁性分离时外部磁性物体置于底部，上下颠倒，多次重复，最终磁体在上，瓮棺土样在下，直接从下口除去土样和多余液体。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤7）中，若检测结果含有抗体，需在结果中排除。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中，所述氨基化的磁性纳米颗粒的合成步骤为：

a. 称取4.78g FeCl₃·6H₂O和2.78g FeSO₄·7H₂O溶解在蒸馏水中，将溶液倒入容器中，在充氮气的条件下搅拌至溶解；加入3.2g NaOH，80-90℃水浴持续搅拌0.5-1.5h制得Fe₃O₄磁性纳米颗粒，磁性分离，倒掉上清液，用乙醇和蒸馏水多次洗涤保存在去离子水中；

b. 移取500mg含有纳米磁珠的磁性液体，溶解在250-350mL无水乙醇中，超声至完全分散，加入25-35mL APTES，用氨水调节pH至10.5-11.5，然后在55-65℃水浴中搅拌反应4-6h；结束后，用无水乙醇洗涤。