[发明专利]Taq DNA聚合酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了Taq DNA聚合酶突变体及其应用。本发明提供了一种热稳定性提高的Taq DNA聚合酶单位点突变体，该突变体通过将SEQ ID No.1所示氨基酸序列进行G79E、G80A、D177E、A180V、E189P、S357A、A472E或G504K中的单位点突变所获得的突变体。在单位点突变的基础上，本发明提供了热稳定性进一步提高的Taq DNA聚合酶多位点突变体。qPCR热稳定性检测表明，本发明提供的Taq DNA聚合酶单位点或多位点突变体较野生型酶活有显著提高，热稳定性明显优于野生型Taq DNA聚合酶。本发明还提供了所述突变体作为Taq DNA聚合酶在基因扩增中的用途。

技术领域

本发明涉及聚合酶突变体，尤其涉及热稳定性提高的Taq DNA 聚合酶突变体及其应用，属于Taq DNA 聚合酶突变体领域。

背景技术

Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，最初由Saiki等从温泉中分离的一株水生噬热杆菌（thermus aquaticus）中提取获得。此酶能耐高温，在分子克隆中Taq DNA聚合酶可用于DNA序列测定并可利用聚合酶链式反应（polymerase chainreaction，PCR）对DNA的特定片段进行体外扩增。在PCR过程中，由于Taq DNA聚合酶在变性步骤中（约94℃）不失活，可直接进入第二轮循环，因此不必每轮循环时重新加入新酶，这使得Taq DNA聚合酶成为PCR反应中的独特用酶。

但是Taq DNA聚合酶在PCR扩增过程中如果循环数过多或扩增温度较高就会出现酶活下降，导致扩增结果不准确，因此需要提高其热稳定性。

发明内容

本发明的目的之一将是提供热稳定性提高的Taq DNA 聚合酶单位点突变体；

本发明的目的之二提供热稳定性提高的Taq DNA 聚合酶多位点突变体；

本发明的目的之三是提供制备所述Taq DNA 聚合酶单位点突变体或多位点突变体的方法；

本发明的目的之四是将所述的Taq DNA 聚合酶单位点突变体或多位点突变体应用于聚合扩增。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：

作为本发明一种具体的实施方式，本发明提供了一种热稳定性提高的Taq DNA 聚合酶单位点突变体，该突变体通过将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行G79E、G80A、D177E、A180V、E189P、S357A、A472E或G504K中的任何一种氨基酸单位点突变所获得的突变体；优选的，将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行G79E、A180V或G504K中的任何一种氨基酸单位点突变所获得的突变体；更优选的，将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行A180V或G504K中任何一种氨基酸单位点突变所获得的突变体。

本发明单位点突变体“G79E”表示将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的Taq DNA 聚合酶的第79位氨基酸由甘氨酸（G）突变成谷氨酸（E）； 本发明其余的单位点突变的表述依此类推。

作为本发明一种具体的实施方式，本发明提供了一种热稳定性提高的Taq DNA 聚合酶多位点突变体，所述多位点突变体选自以下(a）-(d)中的任何一种：

（a）将EQ ID No.1所示的氨基酸序列同时进行A180V 和G504K两个位点突变得到的突变体（A180V/ G504K）；

（b）将EQ ID No.1所示的氨基酸序列同时进行G79E 和E189P两个位点突变得到的突变体（G79E /E189P）；

（c）将EQ ID No.1所示的氨基酸序列同时进行A180V 、 G504K 、G79E 和E189P四个位点突变得到的突变体（A180V /G504K /G79E /E189P）；