[发明专利]一种绿色荧光蛋白替换Fiber-2的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法

说明书

本发明涉及一种绿色荧光蛋白替换Fiber‑2的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，本发明利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体，将病毒的毒力基因之一F2进行删除，纯化后成功获得了表达EGFP的F2完全缺失的重组FAdV4病毒，在体内及体外实验结果均显示，FAV4‑EGFP‑rF2重组病毒毒力显著降低，且攻毒后保护率很好，由此可见，本发明提供的F2完全缺失型重组病毒不仅能够为FAdV‑4的防控提供生物材料，同时EGFP替换F2的位置可以作为插入其他病原保护性抗原的插入位点，为构建FAdV‑4重组多价苗提供了坚实的理论依据。

技术领域

本发明涉及一种绿色荧光蛋白替换Fiber-2的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型。虽然在世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给国内养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，目前高致病性4型FAdV在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无FAdV-4的疫苗。此前有报道五邻体、六邻体、纤突蛋白F1和纤突蛋白F2等亚单位疫苗均能够提供一定的保护率，考虑到亚单位疫苗的保护率不如全病毒灭活苗，而全病毒灭活苗的制备成本较高，且不能激活机体的细胞免疫。因此，考虑本发明的亮点是将禽腺病毒的毒力基因删除，获得高度致弱的禽腺病毒，作为一种弱毒疫苗，能够同时激活机体的体液免疫和细胞免疫，达到很好的保护力。与此同时，F2基因删除的位置也可以考虑作为外源基因的插入位点，从而插入外源基因，构建二价苗，甚至多价苗。

CRISPR-Cas9技术作为古细菌的免疫系统，近年来得到了快速的发展和应用，从真核生物到原核生物，从病毒到真菌，被广泛应用于各个方面。本发明利用CRISPR-Cas9技术对禽腺病毒进行编辑，通过同源重组修复，获得F2完全缺失的重组血清4型禽腺病毒，为禽腺病毒的防控打下坚实的理论基础。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种绿色荧光蛋白替换Fiber-2的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，可供插入其他病原保护性抗原的位点。本发明的原理和最核心的关键技术是通过CRISPR-Cas9技术将毒力基因F2删除，并用标签蛋白EGFP替换。随后利用EGFP进行病毒纯化，获得可以稳定扩增的重组禽腺病毒。

本发明的目的是这样实现的，一种绿色荧光蛋白替换Fiber-2的重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，其载体为野生型血清4型禽腺病毒SD株；

所述重组血清4型禽腺病毒的外源基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP，在激发光的照射下发出绿色荧光，作为插入位点的荧光标签分子，其序列如SEQ ID NO.1所示；

SEQ ID NO.1为：