[发明专利]一种内皮祖细胞外泌体医用敷料、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种内皮祖细胞外泌体医用敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.三维培养得到内皮祖细胞；

b.采用含无外泌体血清的培养基培养步骤a中得到的内皮祖细胞，得到上清液，将上清液通过差速离心后制备外泌体；

c.在聚己内酯高分子膜复合层表面涂覆一层步骤b中得到的外泌体及一层水凝胶溶液后静置，凝固后得到外泌体医用敷料，或将步骤b中得到的外泌体制成外泌体冻干粉，将外泌体冻干粉与纯化水和/或透明质酸钠混合后得到喷剂型外泌体医用敷料。

2.根据权利要求1所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料的制备方法，其特征在于，步骤a中三维培养的具体步骤包括：

(1)将人脐带血来源的内皮祖细胞使用完全培养基接种至培养瓶中，并使内皮祖细胞密度达到90％，得到原代内皮祖细胞；

(2)将原代内皮祖细胞接种至细胞培养器中，然后在水平转速为20rpm～40rpm条件下旋转培养内皮祖细胞，得到分散好的内皮祖细胞，其中，细胞培养器的底部的内表面为弧面且经过抗细胞贴附处理；

(3)采用聚氟乙烯合成纤维材料为载体，将分散好的内皮祖细胞按3x10⁵cells/mL的密度接种入装有载体的培养容器中，接种细胞，并充分混匀，且每10～30min混匀一次，持续3～6h，待细胞粘附于载体后，每日换液一次，持续4天，收集得到三维培养的内皮祖细胞。

3.根据权利要求2所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料的制备方法，其特征在于，所述载体为经过灭菌的，所述灭菌的具体步骤为：

将适量无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS溶液完全浸泡载体，并用玻璃质容器储存，然后在121℃高压蒸汽中灭菌30min，去除PBS溶液后，得到灭菌的载体。

4.根据权利要求2所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料的制备方法，其特征在于，所述载体的用量为25.0～30.0g/L。

5.根据权利要求1所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料的制备方法，其特征在于，步骤b中将上清液差速离心的具体步骤包括：

(1)用台式常温离心机，将所述培养上清液在常温下以1000g以下转速离心10分钟，得到离心液；

(2)将离心液在4℃温度下，以10000g以上转速离心30分钟，得到超滤液；

(3)将超滤液用0.22μm过滤器过滤，得到浓缩液；

(4)将所述浓缩液在4℃条件下，以100000g以上转速离心70分钟，弃上清得到所需外泌体。

6.一种内皮祖细胞外泌体医用敷料，其特征在于：根据权利要求1-5任一所述的制备方法得到。

7.根据权利要求6所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料在治疗糖尿病足、褥疮、烧伤、烫伤、切割伤、擦伤或战创伤时作为敷料促进伤口愈合的应用。