[发明专利]一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法

权利要求书

1.一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，其特征在于，该方法包含：毛竹幼胚愈伤组织的诱导、毛竹愈伤组织的增殖、转化载体pER8-WUS-RdCodA的构建、农杆菌侵染、毛竹抗性愈伤组织的筛选与不定芽的分化、转基因植株再生与炼苗移栽和毛竹转基因再生植株检测；

所述毛竹幼胚愈伤组织的诱导，包含：

对未成熟毛竹种子灭菌后，将胚剥离于愈伤诱导培养基上，25±1℃暗培养，以诱导出愈伤组织；其中，所述愈伤诱导培养基的组分包含：MS培养基、2.0～6.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；

所述毛竹愈伤组织的增殖，包含：

将所述愈伤组织转置于继代培养基中进行继代培养，25±1℃暗培养；其中，所述继代培养基的组分包含：MS培养基、0.1mg/L或1.0mg/L的2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；采用含0.1mg/L 2,4-D的继代培养基和1.0mg/L 2,4-D的继代培养基交替进行继代培养；

所述转化载体pER8-WUS-RdCodA的构建，包含：

将雌二醇诱导载体pER8进行Xho I/Spe I双酶切，以获得pER8线性化载体；在玉米WUS基因两端加入载体同源序列，并通过同源重组的方法将其插入pER8线性化载体中，获得重组载体pER8-WUS；采用EcoR V对重组载体pER8-WUS进行单酶切，获得载体片段；将Rd29A启动子诱导的CodA基因完整表达框插入经单酶切获得的pER8-WUS载体片段的EcoRV位点，以构建转化载体pER8-WUS-RdCodA；

所述农杆菌侵染，包含：

将所述转化载体pER8-WUS-RdCodA通过电激法转化农杆菌感受态细胞EHA105，挑单克隆于含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YM培养基上划线，28±1℃培养；收集农杆菌菌体，将其悬浮于液体继代培养基中，不断晃动至菌体OD₆₀₀为0.3～0.6，得到侵染液，在侵染液中添加乙酰丁香酮，乙酰丁香酮的浓度为100μmol/L；

在侵染时，挑选白色愈伤组织加侵染液侵染，结束后吸干叶片上残留的侵染液，叶片移至共培养基上，在温度25±1℃，暗培养；其中，所述共培养基的组分包含：所述继代培养基和100μmol/L乙酰丁香酮；

所述毛竹抗性愈伤组织的筛选与不定芽的分化，包含：

将共培养后的愈伤组织转入筛选培养基，培养温度25±1℃，暗培养，将新长出的愈伤在筛选培养基上继代培养后转入分化培养基，培养条件为温度25±1℃，光照；其中，所述筛选培养基的组分包含：所述继代培养基、1～5μmol/L雌二醇、20mg/L潮霉素、300mg/L头孢霉素；所述分化培养基的组分包含：MS培养基、2.0mg/L 6-BA、1.0mg/L KT、0.5mg/L NAA、20mg/L潮霉素、300mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；

所述转基因植株再生与炼苗移栽，包含：

选取健壮的不定芽，移入生根培养基，培养温度25±1℃，光照，待根系形成后将幼苗移入生长培养基，培养温度25±1℃，光照；待根系发达，苗长到5cm以上时进行移栽；其中，所述生根培养基的组分包含：1/2MS培养基、2.0mg/L吲哚丁酸、300mg/L头孢霉素、20g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；所述生长培养基的组分包含：MS培养基、30g/L蔗糖、300mg/L头孢霉素、7g/L琼脂，pH＝5.8。

所述毛竹转基因再生植株检测，包含：

采用CTAB法提取毛竹转基因再生植株基因组DNA，以非转基因毛竹为阴性对照，以含有CodA基因的质粒为阳性对照，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行凝胶电泳及成像检测，确定转基因阳性植株。