[发明专利]一种甾体16β-羟化酶CYP65重组酵母菌的构建及其应用

说明书

本发明专利提供了一种表达甾体16β‑羟化酶CYP65的重组酵母菌，它能够高效转化甾体底物4‑AD，进而高效制备C16β‑OH‑4‑AD。具体涉及利用基因工程技术构建了两个敲除载体，并根据同源重组的原理定向敲除了酵母NS17中的醛酮还原酶基因GCY1和YPR1，获得了一个双敲除醛酮还原酶基因GCY1和YPR1的酵母菌NS17平台。同未改造的酵母NS17菌株相比，该双敲除酵母菌株对底物4‑AD的还原明显减少。将表达载体pYES2‑CYP65分别转化至双敲除酵母菌株和原始酵母菌株NS17中，结果表明对底物4‑AD的羟化特异性明显提高。

技术领域：

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及利用基因工程技术和分子生物学手段构建一种表达16β-羟化酶的重组酵母菌株，该重组菌株可用于甾体药物中间体C16β-OH-4-AD的高效制备。

背景技术：

甾体激素类药物是指分子结构中含有甾体结构的激素类药物，主要包括肾上腺皮质激素和性激素两大类，它具有抗炎，抗过敏等作用，在临床上有重要的医药价值和药理活性。甾体激素类药物的生理和药理活性取决于甾体骨架特定位点引入的官能基团。目前，主要通过化学合成法和微生物转化法改造甾体的结构。同化学合成法相比，甾体微生物转化有许多优势：首先避免了化学合成法中的步骤繁琐，显著提高了产物得率；其次，微生物转化专一性强，具有较高的立体选择性，极大地减少了副产物的生成；同时微生物转化过程是一个环境友好型绿色过程。

雄甾-4-烯-3，17-二酮(简称4AD)对机体有非常重要的调节作用，同时是一种重要的甾体激素类药物中间体，不仅可以用来合成氢化可的松、黄体酮、地塞米松等多种药物，也可用于生产性激素、皮质激素等多种甾体激素类药物。通过P450羟化酶的作用在母核上直接引入羟基可显著提高其抗炎、抗感染等药理活性。

目前，用于工业生产的甾体微生物转化类型多集中在11α、11β、15α、15β、16α位置的羟基化，而有关C16β羟基化的报道仍然较少。本实验室前期工作鉴定了来源于黑曲霉ATCC1015中的16β羟化酶基因CYP65，该基因编码的羟化酶对甾体4AD具有很强的特异性以及很高的羟化活性。鉴于黑曲霉发酵工艺复杂且投料量低，因此构建一个提高工艺效率、增加投料量且降低生产成本的更高效的工程菌具有重要的工业价值。经过研究发现酵母菌NS17生长更加旺盛，具有更大的研究价值。

酿酒酵母作为一个表达外源基因的平台十分成熟，同时由于酵母NS17具有生长旺盛的特点，因此本发明以酵母NS17作为出发菌株，用于构建一种表达16β-羟化酶的重组酵母菌株。由于酵母NS17中存在GCY1和YPR1两个醛酮还原酶基因，在转化甾体4AD时，会对4AD的第17位酮基造成还原，从而生成双羟产物、影响了C16β-OH-4-AD单羟产物的生成。为了获得C16β-OH-4-AD产物，需要对表达宿主NS17进行改造。本发明利用基因工程技术构建了两个敲除载体，根据同源重组原理依次定向敲除了酵母NS17中的醛酮还原酶基因GCY1和YPR1，再利用该双敲除酵母突变株作为出发菌株对甾体4AD进行转化，结果表明双敲除酵母突变株对4AD的还原程度明显降低。将表达载体PYES2-CYP65导入双敲除突变株内，构建了表达16β-羟化酶的重组酵母菌株，用于高效制备甾体中间体C16β-OH-4-AD。

发明内容：

本发明的目的在于提供了一种表达16β-羟化酶CYP65的重组酵母菌，同时也提供了一个双敲除醛酮还原酶基因GCY1和YPR1的酵母表达平台，为高效制备C16β-OH-4-AD奠定了坚实基础。