[发明专利]一种水曲柳高效遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种水曲柳高效遗传转化方法，选取水曲柳种子浸泡24h，去掉外种皮，表面消毒后进行预培养，在预培养时加柠檬酸钾，将预培养之后的成熟合子胚子叶部分及胚根部分切去，剩余的下胚轴放入WY4培养基中，密封好后，放入超声波清洗机中超声90s，把WY4培养基倒掉，将下胚轴与OD600＝0.6的农杆菌菌液混合后密封好，放入真空装置中，真空泵开启后约3min，真空压力达到0.8Mpa，在此压力下持续10‑15min，关闭真空泵开关，打开阀门，2min后恢复为标准大气压，在超净工作台中将下胚轴取出，无菌滤纸吸去多余菌液后，将下胚轴接入不定芽诱导培养基中，之后按照常规方法进行共培养、脱菌、选择培养、PCR检测，确定转基因植株。该方法的建立，一方面可用于提高水曲柳的转化效率，达到遗传转化的要求；其次，可以用于水曲柳遗传转化辅助育种；第三，也可以通过遗传转化筛选突变体，获得优良品种。

技术领域

本发明涉及一种水曲柳高效遗传转化方法，所属的技术领域为植物生物技术。

背景技术

水曲柳(Fraxinus mandschurica Rupr.)木犀科，白蜡树属，高大落叶乔木，是我国东北素有“三大硬阔”之称的珍贵树木之一，木材材质优良，纹理美观，广泛应用于各领域。水曲柳繁殖主要以种子繁殖，目前对水曲柳种子初生休眠和次生休眠的解除方法已有一定研究,但水曲柳种子萌发也必须经过长达6个月的春化处理，否则需要2-3年才能自然萌发。水曲柳体胚繁殖过程中伴随着外植体的褐化现象，并且水曲柳体胚大部分都产生在褐化的外植体上，以未成熟子叶为外植体，形成体细胞胚需60d，体细胞胚发生率为37.2％,产生体胚的920个外植体中共有842个外植体发生褐化(占发生体胚外植体总数的91.5％)。褐化现象普遍被认为是阻碍组织培养的。因此，这些问题都阻碍了水曲柳体细胞胚的大量繁殖以及在实际中的应用。目前通过对采穗母树、扦插基质、生根粉等方面的研究，已经探索出了各种影响水曲柳生根的因素。但是扦插的效率依然不是非常高，无法满足大规模生产，造成水曲柳育种速度迟缓。

遗传转化辅助育种可以精准的获得需要的良种，提高林木抗性，缩短育种周期，提高育种效率。目前常用的遗传转化法包括聚乙二醇(PEG)法、电穿孔法、微注射法、基因枪法等。遗传转化辅助育种已在多种农林植物中应用，然而在水曲柳中还未见成功的报道，主要原因是一直没有合适的水曲柳不定芽再生体系。发明人在前期研究中建立了通过不定芽直接萌发途径获得水曲柳再生植株的方法，为水曲柳转基因研究提供了技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效的水曲柳遗传转化方法。该方法可以获得抗性苗，提高遗传转化效率。从而为水曲柳精准育种、获得速生和珍贵新品种，缩短育种周期提供重要的技术支持。

为了达到上述目的，本发明选取水曲柳下胚轴为外植体，将下胚轴经过柠檬酸钾预培养之后，放在超声仪中超声，超声结束后与培养好的农杆菌混合，放在真空装置中进行真空渗透，之后按照常规的转基因方法进行共培养、脱菌、选择培养，获得抗性苗再通过分子生物学技术进行检测，确定转基因植株。

一种高效的水曲柳遗传转化方法，关键点在于利用超声加真空渗透辅助进行农杆菌侵染，该辅助方法既可以使下胚轴表面受伤增加不定芽的分化率，又可以增加农杆菌进入下胚轴的概率。

一种高效的水曲柳遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)遗传转化受体的准备：通过双重表面杀菌，获得无菌外植体，对外植体经柠檬酸钾预培养，以待备用；

(2)农杆菌的培养：将有目标基因的载体转化根癌农杆菌菌株LBA4404后，利用YEB培养基进行活化和扩大培养，以待备用；所述YEB培养基上含有50mg/L卡那霉素(Kan)和50mg/L利福平(Rif)；

(3)农杆菌重悬液的制备：将培养好的农杆菌菌液分装于50ml离心管中，5000rpm离心10min，弃去上清，用重悬液重悬菌体沉淀，以待备用；