[发明专利]一种水曲柳高效遗传转化方法

权利要求书

1.一种水曲柳高效遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)遗传转化受体的准备：按照水曲柳种子表面消毒和合子胚预培养方法进行处理，以待备用；

(2)农杆菌的培养：按照常规的菌种活化法进行农杆菌培养，以待备用；

(3)农杆菌重悬液的制备：按照常规的农杆菌菌液重悬法对(2)中获得的农杆菌进行操作，将重悬后的菌液用分光光度计测量OD₆₀₀＝0.6，以待备用；

(4)水曲柳遗传转化受体侵染：在超净工作台中将(1)中预培养3d的水曲柳成熟合子胚子叶部分及胚根部分切去，剩余的下胚轴放入不定芽诱导培养基中，密封好后，放入超声波清洗机中超声90s后把不定芽诱导培养基倒掉，将下胚轴与(3)中的OD₆₀₀＝0.6的农杆菌菌液混合后密封好，放入真空装置中，真空泵开启后约3min，真空压力达到0.8Mpa，在此压力下持续10-15min，关闭真空泵开关，打开阀门，2min后恢复为标准大气压，在超净工作台中将下胚轴取出，无菌滤纸吸去多余菌液后，将下胚轴接入不定芽诱导培养基中。

(5)共培养：将(4)中接种后的下胚轴放在黑暗条件下，25℃培养3d；

(6)脱菌：将(5)中共培养后的下胚轴在无菌条件下用无菌水洗3次，接种在含有500mg/L头孢噻肟钠的不定芽诱导培养基中，连续脱菌3d；

(7)选择培养：将(6)中脱菌后的下胚轴，在无菌条件下接种在含有500mg/L头孢噻肟钠和30mg/L卡那霉素(Kan)的不定芽诱导培养基中，按照下胚轴直接出芽的培养条件进行培养；

(8)抗性苗检测：将(7)中选择培养获得的抗性芽进行常规的DNA提取和PCR检测，根据是否扩增出目的片段，确定是否为转基因植株。