[发明专利]一种提取蚯蚓血红蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种从蚯蚓中提取蚯蚓血红蛋白的工艺方法，用于生物制药领域。该工艺主要包括蚯蚓的前处理、蚯蚓血红蛋白的提取等主要流程。所描述的蚯蚓前处理主要使用闪式提取仪进行蚯蚓血红蛋白的粗提取；所描述的蚯蚓血红蛋白的提取的工艺流程使用的方法为高聚物盐法，将蚯蚓血红蛋白从混合物中分离纯化。本工艺流程相较于传统的工艺流程，具有操作流程简便、成本较低、提取效率高、提取效果好的特点，且产出的蚯蚓血红蛋白性状保持较好，可以用作后续的进一步开发。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种从蚯蚓中提取血红蛋白的方法。

背景技术

蚯蚓血红蛋白，也称为蚯蚓胞外巨大血红蛋白，是广泛存在于蚯蚓体内的一种氧载体蛋白。根据目前的研究得知，其单体结构与人血血红蛋白的单体结构非常相似，且具有更强的氧气的携带运输能力。因此，作为一种重要的、潜在的新型血液替代品受到科学界的关注。

传统的大分子蛋白的提取中，双水相方法是一种常用的方法。当两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐在特定的浓度比例下，或者是在一个特定的温度条件下，就会形成双水相系统。采用双水相分离的物质，会因为酸碱性、温度等条件的改变，自然分成互不相容的两相，从而达到分离的目的。但是传统的双水相方法，在用于蚯蚓血红蛋白的提取过程时，会发生提取不彻底、后续脱盐困难、条件控制难度较高、无法大规模生产等问题，因此，亟需开发一种适于蚯蚓血红蛋白提取的新方法。

发明内容

针对上述技术问题，本发明通过在双水相试验的基础上，探索出的适用于蚯蚓血红蛋白的提取的新方法，即开发了闪式提取技术和硫铵—聚乙二醇相结合的方法来提取蚯蚓血红蛋白。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

一种提取蚯蚓血红蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)取保存于-70℃冰箱中的吐沙洗净后的蚯蚓，置于冷水浴中隔水解冻；

(2)待蚯蚓块解冻至软化时，将其用剪刀预先剪碎成小块，装入不锈钢容器中；

(3)容器中加入预冷的二蒸水，调节蚯蚓与二蒸水的质量比例为1：1～3；

(4)将不锈钢容器放置在闪式提取仪的指定部位，开动机器进行闪式提取，得到粗提蚯蚓液；

(5)将粗提蚯蚓液置于高速离心机中，以10000rpm的转速，4℃的温度，离心30min，取上清液为瑰红色的无杂质的均一液体；

(6)取粗提蚯蚓液的上清液，按一定比例加入预先调配好的聚乙二醇溶液与硫酸铵溶液，涡旋振荡，得到有絮状沉淀的混合液；

(7)将混合液置于离心机中，以5000rpm的转速，4℃的温度，离心10min，去除上清液，用二蒸水小心清洗沉淀上的残留的液体；

(8)将沉淀用与步骤(6)中混合液中加入的蚯蚓上清液等体积的二蒸水复溶，得到均一稳定的蚯蚓血红蛋白溶液；

(9)将蚯蚓血红蛋白溶液透析脱盐后放入冷冻干燥机中，冷冻干燥12-24小时后，得到纯净的蚯蚓血红蛋白干粉。

在具体实施方案中，所述步骤(3)中蚯蚓与二蒸水的质量比例为1：1.5。

在具体实施方案中，所述步骤(4)中闪式提取共进行1～3次，每次提取持续25～40s，每次提取间隔为5～15s；优选地，闪式提取进行2次，每次提取持续30s，每次提取间隔为10s。

在具体实施方案中，所述步骤(6)中预先调配好的聚乙二醇溶液的质量分数为40％，硫酸铵溶液的质量分数为40％。

在具体实施方案中，进一步地，所述步骤(6)中与粗提蚯蚓上清液混合后聚乙二醇的终质量分数范围为11～19％，硫酸铵的终质量分数范围为4～8％。