[发明专利]一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法

说明书

本发明公开一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，具体包括：重组类人胶原蛋白基因序列的设计，具体是：以选取的类人胶原蛋白III的氨基酸序列为基础；根据大肠杆菌的偏好密码子设计出编码重组类人胶原蛋白的基因序列；将重组类人胶原蛋白片段与载体的酶切连接，得到酶切产物；将酶切产物用琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带；将目的条带切胶，进行纯化回收得到类人胶原蛋白片段；将类人胶原蛋白片段与载体进行连接得到类人胶原蛋白片段连接产物；将类人胶原蛋白片段连接产物热转化大肠杆菌感受态细胞得到重组类人胶原蛋白工程菌。采用本发明方法所得重组类人胶原蛋白对人皮肤成纤维细胞和人皮肤角质形成细胞均具有诱导增殖的作用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法。

背景技术

胶原蛋白是结缔组织中极其重要的结构蛋白质，对维护细胞、组织及器官的正常生理功能有着重要作用。胶原蛋白被广泛的应用于医学材料及药物方面、美容化妆品、保健品以及各种实用工业中。然而，使用传统方法制备的动物源胶原有一定的病毒隐患如疯牛病、口蹄疫、猪瘟疫等，特别是应用于人体时易引起异体异种的排异反应，从而限制了胶原蛋白在医药方面的应用。

人类采用基因工程手段生产重组胶原蛋白，这种生产方法有着传统提取方法难以媲美的优势：1)安全可控，相比于传统胶原制备法原料来源的难以追踪和不确定性，利用基因工程技术生产重组类人胶原蛋白的原料成分明确，无病毒感染风险，2)质量可控，基因工程技术可表达特定分子量的类人胶原片段，批次之间重复性好，而提取的胶原蛋白通常为不同种类胶原蛋白的混合产物，批次之间差异大，不利于质量控制，3)较低的排异反应，类人胶原蛋白以人体胶原蛋白基因为基础构建，其免疫排异反应比动物来源的胶原蛋白小。

发明内容

本发明设计出独特基因序列(如SEQ ID No.1所示)的重组类人胶原蛋白，结合与pET24a载体的酶切连接得到酶切产物，基于酶切产物获得类人胶原蛋白片段，并将类人胶原蛋白片段与pET-24a载体进行连接得到PET24-类人胶原蛋白片段连接产物，最终基于PET24-类人胶原蛋白片段连接产物获得重组类人胶原蛋白工程菌。采用此种方法获得的重组类人胶原蛋白工程菌经过培养、蛋白诱导表达及纯化后所得纯化的重组胶原蛋白，纯化过程简单且参数容易控制，且所得纯化的重组胶原蛋白对人表皮细胞、人皮肤成纤维原代细胞在72小时内均具有一定的增殖作用，生物活性高。具体技术方案如下：

一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，包括以下步骤：

重组类人胶原蛋白基因序列的设计，具体是：以选取的类人胶原蛋白III的氨基酸序列为基础；根据大肠杆菌的偏好密码子设计出编码重组类人胶原蛋白的基因序列，并在该序列3’端引入组氨酸纯化标签；

将重组类人胶原蛋白片段与pET24a载体的酶切连接，得到酶切产物，其中：重组类人胶原蛋白的基因序列如SEQ ID No.1所示；

将酶切产物用琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带；

将目的条带切胶，进行纯化回收得到类人胶原蛋白片段；

将类人胶原蛋白片段测定含量，并将类人胶原蛋白片段与pET-24a载体进行连接得到PET24-类人胶原蛋白片段连接产物；

将PET24-类人胶原蛋白片段连接产物热转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)得到重组类人胶原蛋白工程菌。

优选的，重组类人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，将重组类人胶原蛋白片段与pET24a载体酶切连接时的酶切反应体系如下：

含类人胶原蛋白片段的质粒或pET24a质粒：10μl；

10×Fastdigest buffer：10μl；

NdeI：5μl；